添加載銀納米二氧化鈦光亮漆體外細胞毒性及其抗菌性的實驗研究

曾永發　石連水　戴群　等

[摘要] 目的 研究添加載銀納米二氧化鈦（Ag/TiO2）抗菌劑對軟襯硅橡膠光亮漆體外細胞毒性及抗菌性能的影響。方法 制備直徑10 mm、厚度2 mm 的Silagum-Comfort軟襯硅橡膠圓形試樣，隨機分成6組，將Ag/TiO2按0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的重量比分別添加于光亮漆的基質和催化劑中，均勻攪拌后分別涂布于對應組試件表面一遍，制成含不同濃度抗菌劑的軟襯硅橡膠試件；采用噻唑藍比色法檢測軟襯硅橡膠試件對3T3細胞（小鼠胚胎成纖維細胞）的體外細胞毒性；使用粗糙度儀測量軟襯硅橡膠試件表面粗糙度值（Ra）；采用貼膜法檢測軟襯硅橡膠試件的體外抗白色假絲酵母菌性能。結果 各實驗組細胞毒性級別為0～2級。光亮漆的Ra值隨著抗菌劑濃度的增加有所提高，但各濃度抗菌劑組與0組相比無統計學差異。隨著抗菌劑濃度的增加，抗菌率也提高；抗菌劑濃度為2.0%和2.5%時，抗菌率已達到 97.5%和96.5%。結論 Ag/TiO2光亮漆具有良好的抗菌效果，能有效改善軟襯硅橡膠的抗菌性能。

[關鍵詞] 軟襯硅橡膠； 光亮漆； 抗菌劑； 載銀納米二氧化鈦； 白色假絲酵母菌

[中圖分類號] R 783.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.019

軟襯硅橡膠材料因具有良好的理化性能和生物相容性，被廣泛應用在活動義齒修復、阻塞器以及頜面贗復體中；但也存在著不足之處，如表面疏松多孔，難于清潔，易滋生霉菌（尤其是白色假絲酵母菌），引發義齒性口炎，并加速了材料的老化，降低材料性能[1]。對此，國內外學者[1-3]作了一系列相關研究，如在硅橡膠材料中添加抗生素、抗菌劑、表面處理等。

軟襯硅橡膠材料配套使用的光亮漆，其主要成分為聚乙烯硅氧烷，涂敷在軟襯表面上可形成一層連續、均勻的涂層，使材料表面更加光滑，并封閉材料表面小孔。Mainieri等[4]認為聚乙烯硅氧烷基類光亮漆有利于延緩軟襯材料表面老化，并提高其光潔度，延長使用壽命。Ag/TiO2是一種新型的無機抗菌劑，具有抗菌譜廣、抗菌性強、抗菌時效性長等優點[5-7]。基于此，本研究擬通過在光亮漆中加入Ag/TiO2抗菌劑，以評價其對材料體外細胞毒性和抗菌性的影響，旨在尋找一種有效的措施來提高軟襯硅橡膠的抗菌性。

1 材料和方法

1.1 材料

載銀納米二氧化鈦（安徽宣城晶瑞新材料有限公司），Silagum-Comfort軟襯硅橡膠（DMG公司，德國），便攜式表面粗糙度儀（三豐公司，日本），磁力攪拌器（95-1型，上海司樂儀器有限公司），DMEM培養基（Gibico公司，美國），噻唑藍（me-thyl thiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞楓（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美國），環境掃描電子顯微鏡（FEI Quanta 200F型， FEI公司，意大利），液體沙氏培養基（北京索萊寶科技有限公司），改良馬丁瓊脂培養基（青島海博生物技術有限公司）。3T3細胞為小鼠胚胎成纖維細胞，由南昌大學藥理實驗室提供。實驗菌株為白色假絲酵母菌國際標準菌株ATCC90028，由南京便診生物公司提供。

1.2 試件制作

在常溫23 ℃±2 ℃、相對濕度50%±5%的條件下，按照廠家要求，制備成直徑為10 mm、厚度為

2 mm的Silagum-Comfort軟襯硅橡膠圓形試樣若干個。隨機分成6組，將Ag/TiO2按0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的重量比分別添加于光亮漆的基質和催化劑中，利用磁力攪拌器均勻攪拌2 h。均勻攪拌光亮漆基質和催化劑10 s，然后將混合好的光亮漆按要求分別均勻涂布每個試件表面一遍，室溫固化，制成含不同濃度抗菌劑的軟襯硅橡膠試件，試件要求表面光滑、無氣泡和缺陷。各試件蒸餾水超聲振蕩洗滌10 min，分組密封裝袋，滅菌后備用。

1.3 添加Ag/TiO2后光亮漆細胞毒性研究

1.3.1 材料浸提液的制備 從每個濃度試件中隨機挑選1個表面光滑、無氣泡的軟襯試件。試件按照表面積與浸提介質體積比（S/V）為1 cm2·mL-1浸泡于含10%小牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃培養箱中培養72 h，收集浸提液于4 ℃保存。

1.3.2 細胞培養及MTT比色法檢測 采用對數生長期的3T3細胞，經0.125%胰酶消化、吹打分散后計數，用含5%胎牛血清的DMEM培養基配制成濃度為

5.0×104個·mL-1的細胞懸液，按照100 μL/孔（即5×103個/孔）的密度接種于96孔細胞培養板上，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。四周邊緣孔加入100 μL/孔DMEM，作為調零孔。接種24 h后，取出96孔板，棄去舊培養液。實驗組（0組，0.5%組，1.0%組，1.5%組，2.0%組，2.5%組）分別加入50%及100%的材料浸提液，100 μL/孔；陰性對照組加入含10%小牛血清的新鮮DMEM培養基，100 μL/孔；陽性對照組加入0.064%苯酚溶液，100 μL /孔。每組設6個平行復孔，實驗重復3次，結果取均值。置于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養，并放置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。48 h以后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續培養5 h，吸出原培養液加入DMSO 150 μL /孔，室溫下振蕩器振蕩15 min，充分溶解結晶物，最后采用酶標儀測定各孔的光吸收值（OD值），實驗波長為490 nm。通過下式計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR），RGR=實驗組細胞計數/陰性對照組細胞計數×100%。將各濃度組RGR轉化為0～4級材料毒性評級（cyto-xicity scale，CTS）[8]。當RGR≥100%、80%～99%、50%～79%、30%～49%、0～29%時，分別對應細胞毒性等級0、1、2、3、4級。

1.4 添加Ag/TiO2后光亮漆表面粗糙度的測試

從每一濃度組及未涂布光亮漆組選3個試件使用粗糙度儀進行表面粗糙度測試，以輪廓算術平均偏差（Ra）作為表面粗糙度評定參數。所有測試試件經超聲清洗10 min后自然風干，試件測試面朝上置于平臺上。設定取樣長度為0.8 mm，評定長度為4.0 mm，滑行速度為1 mm·s-1。傳感觸針與試件表面垂直。每一試件隨機測3個點，取其平均值。

1.5 抗菌效能測試

1.5.1 實驗菌液配制 采用接種環從連續傳代培養2次后的白色假絲酵母菌（于48 h 內轉接）培養基上挑取少量（刮1～2環）新鮮菌落，混懸于生理鹽水中，通過比濁儀配制成1.0×108 CFU·mL-1的白色假絲酵母菌菌液，然后用液體沙氏培養基稀釋成1.0×106 CFU·mL-1的菌懸液備用。

1.5.2 貼膜法評價抗菌性能 將試件置于直徑60 mm的培養皿中，用微量移液器分別取20 μL菌懸液滴于每個試件表面，覆蓋已消毒的聚乙烯薄膜，鋪平，使菌液均勻接觸樣品表面，置于37 ℃、相對濕度大于90%的培養箱里孵育24 h。隨后每個平皿加入5 mL無菌生理鹽水洗脫液，置于渦旋混合器上劇烈振蕩5 min，充分洗脫附著于試件及覆蓋膜上的白色假絲酵母菌，充分混勻洗脫液，取100 μL接種至固體改良馬丁瓊脂平板上，需氧培養24 h，采用菌落形成單位（colony-forming units，CFU）進行菌落計數。實驗每組設置3組平行組，取平均值。實驗重復3次。

1.5.3 抗菌效能評價 參照中華人民共和國輕工行業標準QB/T2591—2003方法評價抗菌效能[9]，計算公式如下：抑（殺）菌率=（A0-A）/A0×100%，其中A0為對照樣品平均回收菌數，A為實驗樣品平均回收菌數。若抑菌率大于等于50%小于90%，表示實驗樣品有抑菌作用；若抑菌率大于等于90%，表示實驗樣品有較強殺菌作用。

1.6 統計分析

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。各組數據的描述采用均數±標準差，對不同實驗組的比較選用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。若數據的結果不滿足正態分布，則采用Kruskal-Wallis H檢驗分析不同組間的分布差異。

2 結果

2.1 MTT法測定結果

細胞培養48 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，可見陽性對照組細胞數明顯降低，細胞胞體圓縮，大量壞死、崩解；陰性對照組細胞輪廓清晰，呈梭形或多角狀，胞質透明、較大，細胞數明顯增加；實驗組細胞形態無明顯異常，可見少量的細胞碎片和胞體圓縮（圖1）。

細胞毒性測定結果見表1。統計學分析表明，各實驗組、陰性對照組的OD值與陽性對照組之間均有統計學差異（F=24.046，P=0.000；F=16.499，P=

0.001）；除1.5%組的50%濃度浸提液，1.5%組、2.0%組、2.5%組的100%浸提液（P<0.05）外，其余各實驗組與陰性對照組之間均無統計學差異（P>0.05）。各實驗組細胞毒性級別為0～2級。

2.2 添加Ag/TiO2后光亮漆表面粗糙度的測試結果

0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%組及未涂布光亮漆組的Ra值大小依次為：0.363±0.088、0.375±0.073、0.381±0.104、0.392±0.093、0.403±0.109、0.448±0.071、0.415±0.092。Ra值隨著抗菌劑濃度的增加有所提高，但各濃度抗菌劑組與0%組相比無統計學差異（χ2=7.377，P=0.287）。

2.3 抗菌效能檢測結果

各組對白色假絲酵母菌的抗菌結果見表2、圖2。隨著抗菌劑濃度的增加，抗菌率提高；抗菌劑濃度為2.0%和2.5%時，抗菌率已達到 97.5%和96.5%。

3 討論

3.1 Ag/TiO2無機抗菌劑的選擇

Ag/TiO2是一種新型無機抗菌劑，具有抗菌譜廣、殺菌力強、安全、持久、無耐藥性等特點。Ag/TiO2是以工業偏鈦酸為原料制備成納米偏鈦酸后，采用物理和化學方法防止顆粒在干燥和鍛燒過程中團聚長大，利用分子活化作用，將銀嵌入TiO2晶體，使兩者的光催化抗菌性能相結合[10]。Ag+沉積到納米TiO2表面，一方面可有效防止TiO2光催化時產生電子-空穴對復合，提高TiO2的光催化活性；一方面又可與其酶蛋白中的-SH結合，致使代謝關鍵酶失活，細菌無法代謝而死亡[11]；同時，Ag+還可與致病菌DNA堿基結合并形成交叉鏈接，置換嘌呤和嘧啶中相鄰氮之間的氫鍵，使DNA變性而不能復制，導致致病菌失活。

Ag/TiO2抗菌劑避免了一般銀系抗菌劑殺菌后產生的內毒素造成的后期污染，并克服了納米TiO2抗菌活性光照條件的限制，實現了Ag+的緩釋，從而延長了殺菌功效；同時也可避免普通銀系抗菌劑存在的氧化后易變黑等問題[7]。

在口腔醫學領域已經有Ag/TiO2抗菌劑應用的相關研究，如陳良建等[12]將Ag/TiO2粉末按不同質量分數添加至硅橡膠中，結果發現：添加Ag/TiO2后硅橡膠具有良好的抗菌性能，而且無細胞毒性，對細胞的黏附也無影響。劉杰等[13]將Ag/TiO2添加于義齒樹脂基托材料中，結果顯示可以顯著提高樹脂基托抗菌性能，而且抗菌效果持久穩定。

3.2 添加Ag/TiO2后光亮漆體外細胞毒性研究

MTT比色法是一種能快速檢測細胞增殖、細胞毒性的比色分析法，已被廣泛應用于免疫學、腫瘤學、藥物毒理學和醫用材料的生物相容性評價。MTT比色法的原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能還原外源性MTT，使其成為非水溶性的藍紫色結晶物——甲瓚并沉積于細胞中，死細胞則不具備此功能；加入DMSO后能溶解細胞中的甲瓚，最后采用酶標儀測定其OD值。在一定細胞數范圍內，形成的MTT結晶量與活細胞數成正比關系；因此，根據測得的OD值可判斷活細胞數量[14]。本研究結果顯示：材料的細胞毒性隨著抗菌劑濃度的提高有所增強，各實驗組細胞毒性評級為0～2級，均符合國家醫療器械檢測的相關標準[8]。本結果與任艷云等[15]和陳良建等[8]的研究結果相一致。

3.3 添加Ag/TiO2后對光亮漆表面粗糙度的影響

粗糙的表面可為微生物的滯留和感染提供條件，在此部位微生物可受到保護，抵抗機械性應力的清洗；同時粗糙的表面可提供較大的表面積，使黏附的菌量更大。鄧華頡等[16]研究表明軟襯材料表面的光滑度可影響白色假絲酵母菌在材料表面的黏附，白色假絲酵母菌的黏附量和材料表面粗糙度呈正相關，光滑面較粗糙面黏附少。Zissis等[17]研究認為軟襯表面粗糙度值低于0.2 μm時未發現菌斑附著，他們認為這是軟襯材料無菌斑積累和黏附的一個臨界閾值。由于軟襯材料不易拋光的特點，表面粗糙度都較高，易黏附和滋生菌斑。

通過表面粗糙度儀可以將粗糙度量化表征，常用的表面粗糙度評定參數有微觀不平度十點高度（Rz）、Ra和輪廓最大高度（Ry）。本實驗選用Ra值來表征所測試件的表面粗糙度，結果直接、準確和客觀，便于量化分析。從結果可以看出，光亮漆的Ra值隨著抗菌劑濃度的增加有所提高，但相比0組差異無統計學意義。未涂布光亮漆組Ra值也明顯高于0%組，說明光亮漆能降低材料的表面粗糙度。

3.4 抗菌效能的檢測

Ag/TiO2抗菌劑的添加量是抗菌光亮漆應用于臨床需確定的重要參數之一，增加抗菌劑的添加量有助于提高材料的抗菌性能，但過量可能會影響原材料性能。貼膜法能定量描述材料抗菌性能，具有簡便易于掌握、結果重復性好的優點，是目前常用的抗菌性能檢測方法之一[18]。本研究采用貼膜法檢測材料的抗菌性能，結果顯示：隨著Ag/TiO2添加量的增加，抗菌率也隨之提高，當Ag/TiO2添加劑為2.0%和2.5%時，抗菌率已達到97.5%和96.5%。這可能與光亮漆表面Ag/TiO2的暴露量有關，濃度較低時，Ag/TiO2暴露量有限，抗菌率也低；抗菌劑添加量增加時，抗菌率也隨之提高，當Ag/TiO2添加量達到2.0%以上時即具有良好的抗菌性。

綜上，本研究認為添加Ag/TiO2光亮漆能有效地提高硅橡膠軟襯材料的抗菌性，而且細胞毒性小。Ag/TiO2的添加量為2.0%時抗菌性最佳，而且表面粗糙度也無明顯的改變。但是硅橡膠軟襯平均使用壽命為1～2年，本實驗僅證明添加Ag/TiO2后材料短期內具有抗菌性，隨著時間的推移，光亮漆中添加的Ag/TiO2可能會溶解游離出來，降低其抗菌濃度，進而影響遠期的抗菌性。關于這一點學者進行過相關研究，葛亞麗等[19]對添加Ag/TiO2的抗菌基托進行自然老化和加速老化熱處理，認為其抗菌效果持久穩定。關于添加抗菌劑后對光亮漆的機械、物理性能是否會產生影響，還有待于進一步的研究。

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（本文編輯 李彩）