基質細胞衍生因子—1刺激對周期性牽張力作用下ATDC5細胞的趨化因子受體4、白介素—6、膠原X表達的影響

匡斌　王慶昱　宋容　等

[摘要] 目的 探討誘導后ATDC5軟骨細胞在20%形變的周期性牽張力及基質細胞衍生因子-1（SDF-1）刺激下，趨化因子受體4（CXCR4）、白介素（IL）-6及膠原X的表達變化，以期深入研究SDF-1/CXCR4信號軸在軟骨細胞分化中的作用機制。方法 ATDC5細胞系經胰島素鐵硒傳遞蛋白（ITS）誘導3周后，分為加力和不加力兩大組，每大組又分為對照組和SDF-1組。對加力組施以20%形變的拉伸力12 h。加力結束后，對各組細胞提取總蛋白，對CXCR4、IL-6及膠原X的蛋白表達進行Western blot檢測。結果 在不加力狀態下，給予SDF-1刺激后，軟骨細胞CXCR4、IL-6及膠原X的表達都出現了不同程度的增強；而在20%形變力和SDF-1的雙重刺激下，此3種因子的表達出現進一步增強。結論 在異常應力作用下，SDF-1可通過上調其特異性受體CXCR4的表達進而增大與其結合的效率，最終促使SDF-1/CXCR4信號軸的激活，促進IL-6等炎癥因子的表達增強，以及直接促進軟骨細胞的肥大向分化，進而膠原X的表達量增高。

[關鍵詞] 顳下頜關節骨關節病； 基質細胞衍生因子-1； 趨化因子受體4； 周期性張應力

[中圖分類號] Q 257 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.015

在關于顳下頜關節骨關節病（osteoarthritis，OA）病因的討論中，異常機械應力越來越受到人們的關注。應力對髁突軟骨細胞而言是一種外源性機械刺激信號，在異常應力作用下，髁突軟骨細胞可分泌多種細胞因子，可能對關節組織造成損害。基質細胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）/趨化因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）相互作用時，通過誘導促炎細胞因子的釋放如白介素（interleukin，IL）等而引起OA軟骨的破壞[1]。ATDC5細胞是從AT805胚胎瘤中分離的軟骨前體細胞系，其為軟骨內成骨過程提供了一個良好的軟骨細胞礦化成熟體外細胞實驗模板，廣泛應用于軟骨細胞調控機理的研究。本研究擬通過體外誘導ATDC5細胞分化為軟骨細胞，并進行周期性張應力及SDF-1刺激，并分別檢測CXCR4、IL-6及膠原X的表達變化，以期在前期實驗的基礎上，進一步探討SDF-1/CXCR4信號軸在OA中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

SDF-1（Peprointech公司，英國），抗-CXCR4抗體（兔單克隆來源，Abcam公司，美國），抗-IL-6抗體（兔多克隆來源）、抗-膠原X抗體（山羊多克隆來源）（Santa Cruz公司，美國），ATDC5細胞系（蘇州百奇生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ATDC5細胞系的培養和誘導 ATDC5細胞置于培養基（DMEM/F12）中，加入10%胎牛血清、

50 U·mL-1青霉素、50 U·mL-1鏈霉素。細胞每2 d換液1次，保持細胞的對數生長，培養瓶放于37 ℃、5%

CO2的細胞培養箱內。待細胞穩定后，更換含有10%胰島素鐵硒傳遞蛋白（insulin-transferring-selenium，ITS）的培養液誘導3周。

1.2.2 實驗分組 將誘導的細胞消化后分別接種于普通六孔板和彈性膜六孔板中，分為加力和不加力兩個大組，每大組又分對照組和SDF-1組（100 ng·μL-1）。加入以上試劑8 h后，將彈性膜六孔板連接到可控氣液壓細胞加載裝置并置于細胞培養箱中，設置為20%形變的拉伸力，0.2 Hz。連續加力12 h后，將彈性膜板及普通板上的細胞用專用刮匙取下。

1.2.3 蛋白提取 無菌PBS洗各組細胞3次；加入放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）蛋白裂解液；冰上放置20 min；收集裂解液后，

12 000 r·min-1離心10 min；吸取上清，進行總蛋白定量，分裝，保存在-80 ℃備用。

1.2.4 Western blot檢測 蛋白經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳60 V電泳1.5 h。電轉完畢，取下膜片，加入5%脫脂奶粉，于搖床搖蕩封閉1 h以消除非特異背景。封閉完畢，洗掉牛奶，分別加入相應一抗（1︰200），4 ℃ 孵育24 h，使一抗與特異蛋白結合。洗去一抗后，加入相應二抗37 ℃ 孵育1 h，電化學發光試劑盒化學發光后曝光成像。同時以β-

actin作為內參。

2 結果

3 討論

應力加載是調節細胞新陳代謝的關鍵因素之

一[2-4]。軟骨組織在受到壓縮力作用的情況下，由于受到膠原及其他細胞外基質的牽拉作用，軟骨細胞實際受到的是一種拉伸力[5]。在正常活動的情況下，關節軟骨細胞受到大約5%的伸長[6]。目前國外的研究主要都對軟骨細胞施予周期性拉伸力。

軟骨細胞對機械負荷極度敏感，關節軟骨物理化學環境的動態變化可影響軟骨細胞的新陳代謝[7]。以前使用生物拉伸力培養體系研究[8]發現，軟骨細胞承受拉伸力時可維持其表型，由加力裝置引起的周期性拉伸力可致軟骨細胞首先增殖，然后成熟和肥大。加力大小對軟骨細胞所產生的效應非常重要。已有研究[9]證明不同強度的加力，可對軟骨細胞功能產生不同作用。低強度的拉伸力會促進軟骨細胞產生蛋白聚糖、Ⅱ型膠原等細胞外基質作用，甚至可產生抗炎作用。但在高強度拉伸力作用下，既可通過直接激活核轉錄因子kB通路進而誘導IL-1等炎癥因子的分泌，也可以直接誘使IL-1、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9的生成[10]。高強度周期性拉伸力加載于軟骨細胞中，可減少軟骨基質的合成，進而導致軟骨組織抵抗外來刺激的能力降低。因此在本實驗中使用強度為20%的拉伸力對軟骨細胞更可能產生一種負面作用。Honda等[11]報道高強度周期性拉伸力加載于軟骨細胞中，可使細胞形態發生變化，從多邊形到紡錘形。而本實驗中使用強度為20%的周期性拉伸力時，在經受加力和/或SDF-1刺激后，軟骨細胞形態未見明顯異常，未發現壞死細胞，細胞排列相對有序。

已有研究[1]表明SDF-1/CXCR4信號通路在OA及類風濕性關節炎患者病理進程中起關鍵作用。前期動物實驗也證明其破壞關節軟骨的作用可能是通過骨髓腔及滑膜細胞分泌高濃度的SDF-1，后者再與關節軟骨細胞上的CXCR4受體結合，誘導軟骨細胞分泌大量的IL-6及MMP。相關研究[12]報道，在人類關節炎中，滑膜切除術致SDF-1濃度降低或抗CXCR4抗體阻止CXCR4的表達，會使MMP13表達降低和減弱軟骨的破壞。這些研究都有力證明SDF-1/CXCR4信號通路在OA病理進程中的重要作用。本研究結果發現在不加力狀態下，給予SDF-1刺激后，軟骨細胞CXCR4、IL-6的表達都出現了不同程度的增強；而在20%形變力和SDF-1的雙重刺激下，此兩種因子的表達出現進一步增強。以上結果說明，SDF-1刺激可上調其特異性受體CXCR4的表達，而隨著受體的上調，則反過來增加了與配體SDF-1結合的可能性，最終促使軟骨細胞SDF-1/CXCR4信號通路的激活，而該信號軸下游因子IL-6的表達增強，也證實了這種推測。20%的拉伸力超出了軟骨細胞正常的受力范圍，這正是為了模擬體內顳下頜關節軟骨細胞由于漸進性咬合紊亂而受到的異常力刺激。本實驗結果證實此種異常力的確可對軟骨細胞CXCR4等的表達產生促進作用，這也與動物實驗中的結果相對應。

在機械負荷下，軟骨中的膠原X是敏感因子之一[8]，本實驗中對照組軟骨細胞在加力狀態下膠原X的表達比不加力時更強，證實在此種異常力作用下，軟骨細胞出現肥大化傾向，這也與動物實驗中實驗組軟骨內成骨增強及鈣化軟骨增厚相一致。此外，SDF-1這種趨化因子似乎還可促進軟骨細胞X型膠原的表達，在加力狀態下這種趨勢仍然明顯。這說明SDF-1/CXCR4信號軸可直接調控軟骨細胞的分化。

綜上所述，軟骨細胞在異常應力作用下，SDF-1可通過上調其特異性受體CXCR4的表達進而增大與其結合的效率，最終促使SDF-1/CXCR4信號軸激活，一方面導致如IL-6等炎癥因子的表達增強，從而對軟骨組織造成直接破壞；另一方面還可直接促進軟骨細胞的肥大向分化，從而促進髁突軟骨的軟骨內成骨，促使其發生間接退變。

[參考文獻]

[1] Chen HT， Tsou HK， Hsu CJ， et al. Stromal cell-derived factor-1/CXCR4 promotes IL-6 production in human syno-vial fibroblasts[J]. J Cell Biochem， 2011， 112（4）：1219-1227.

[2] LaPlaca MC， Cullen DK， McLoughlin JJ， et al. High rate shear strain of three-dimensional neural cell cultures： a new in vitro traumatic brain injury model[J]. J Biomech， 2005， 38（5）：1093-1105.

[3] Nicolella DP， Moravits DE， Gale AM， et al. Osteocyte lacu-nae tissue strain in cortical bone[J]. J Biomech， 2006， 39（9）：

1735-1743.

[4] Sato K， Adachi T， Ueda D， et al. Measurement of local strain on cell membrane at initiation point of calcium signaling response to applied mechanical stimulus in osteoblastic cells

[J]. J Biomech， 2007， 40（6）：1246-1255.

[5] Holmvall K， Camper L， Johansson S， et al. Chondrocyte and chondrosarcoma cell integrins with affinity for collagen type Ⅱ and their response to mechanical stress[J]. Exp Cell Res， 1995， 221（2）：496-503.

[6] Agarwal S， Deschner J， Long P， et al. Role of NF-kappaB transcription factors in antiinflammatory and proinflam-matory actions of mechanical signals[J]. Arthritis Rheum， 2004， 50（11）：3541-3548.

[7] Lee DA， Noguchi T， Frean SP， et al. The influence of me-chanical loading on isolated chondrocytes seeded in agarose constructs[J]. Biorheology， 2000， 37（1/2）：149-161.

[8] Wu QQ， Chen Q. Mechanoregulation of chondrocyte pro-liferation， maturation， and hypertrophy： ion-channel depen-dent transduction of matrix deformation signals[J]. Exp Cell Res， 2000， 256（2）：383-391.

[9] Agarwal S， Long P， Gassner R， et al. Cyclic tensile strain suppresses catabolic effects of interleukin-1beta in fibro-chondrocytes from the temporomandibular joint[J]. Arthritis Rheum， 2001， 44（3）：608-617.

[10] Kamiya T， Tanimoto K， Tanne Y， et al. Effects of mecha-nical stimuli on the synthesis of superficial zone protein in chondrocytes[J]. J Biomed Mater Res A， 2010， 92（2）：801-

805.

[11] Honda K， Ohno S， Tanimoto K， et al. The effects of high magnitude cyclic tensile load on cartilage matrix metabo-lism in cultured chondrocytes[J]. Eur J Cell Biol， 2000， 79

（9）：601-609.

[12] Kanbe K， Takemura T， Takeuchi K， et al. Synovectomy reduces stromal-cell-derived factor-1（SDF-1） which is in-volved in the destruction of cartilage in osteoarthritis and rheumatoid arthritis[J]. J Bone Joint Surg Br， 2004， 86（2）：

296-300.

（本文編輯 杜冰）