唑來膦酸對破骨細胞黏附及整合素αv、β3基因表達的影響

林玨杉　董偉　徐純峰　等

[摘要] 目的 研究唑來膦酸（ZOL）對破骨細胞黏附以及整合素αv和β3基因表達的影響。方法 體外誘導小鼠RAW264.7細胞向破骨細胞分化，通過抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及牙本質吸收陷窩檢測以評價破骨細胞生成情況。將細胞分為對照組及ZOL處理組兩組，后者用1×10-6 mol·L-1的ZOL處理2 d，用結晶紫染色法檢測細胞黏附情況，用實時熒光定量聚合酶鏈反應、Western blot和免疫熒光化學法檢測整合素αv、β3 mRNA及蛋白表達水平。結果 TRAP染色及牙本質吸收陷窩檢測提示有多核破骨細胞生成。ZOL處理組破骨細胞黏附能力較對照組顯著降低（P<0.01）。ZOL處理組整合素αv、β3 mRNA水平分別為0.66±0.05、0.59±0.08，顯著低于對照組的1.01±0.01和1.01±0.02（P<0.01）；蛋白表達水平分別為31 934.84±112.91、18 812.79±194.13， 較對照組（52 517.81±211.72、

31 441.93±456.87）分別下降了39.19%和40.17%（P<0.01）。免疫熒光化學檢測顯示，ZOL處理使整合素αv、β3熒光強度（9.491±0.748、4.744±0.759）較對照組（15.159±1.143、11.418±1.095）分別降低了37.39% 和58.45%（P<0.01）。結論 ZOL可抑制破骨細胞黏附并下調整合素αv、β3表達；ZOL的上述作用可能參與對破骨細胞性骨吸收的抑制。

[關鍵詞] 唑來膦酸； 破骨細胞； 細胞黏附； 整合素αv和β3； 封閉區

[中圖分類號] Q 26 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.004

3 討論

整合素是細胞表面重要的黏附受體，是由α、β兩個亞基組成的異源二聚體，參與細胞與基質、細胞與細胞間的接觸[2]。破骨細胞表面主要表達整合素αv和β3，通過與骨橋蛋白、骨涎蛋白、玻連蛋白等骨基質蛋白內的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列結合，調控破骨細胞的黏附、遷移、封閉區形成及骨吸收[5]。

研究[2，6]表明，許多信號分子參與了整合素αv、β3介導的信號調控。整合素αv、β3與骨基質蛋白中RGD序列結合，從而使細胞質與其結合的c-Src活化，并與適配蛋白脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）形成復合體。Syk通過SH2功能域與破骨細胞表面DNAX活化蛋白12（DNAX-activating protein 12，Dap12）的免疫酪氨酸活化基序（immu-noreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）功能域結合。活化的c-Src使Syk磷酸化，進而激活下游信號分子SLP-76（含有SH2結構域的相對分子質量為7.6×104的白細胞蛋白）和鳥嘌呤轉換因子Vav3，使無活性的Rac轉變成活性Rac，從與二磷酸鳥苷（gua-nosine diphosphate，GDP）結合轉變成與三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）結合；從而誘發破骨細胞的細胞骨架重排形成肌動蛋白環。整合素αv、β3分布于肌動蛋白環的內側和外側，形成封閉區，為骨吸收提供所需的微環境。

整合素αv、β3功能改變會對破骨細胞黏附、細胞骨架重排及封閉區形成產生重要影響。整合素β3基因敲除小鼠表現出明顯的骨量增加，這與破骨細胞介導的骨吸收障礙有關[7]。即使在RANKL和巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factors，M-CSF）作用下，整合素β3-/-破骨細胞也不能形成肌動蛋白環，骨吸收活性明顯下降[8]；整合素β3點突變會使破骨細胞遷移能力顯著降低[9]。雙膦酸鹽作為破骨細胞的有效抑制藥物，能否通過影響整合素αv、β3來發揮對破骨細胞的抑制作用，目前尚不清楚。在本研究中，應用RANKL誘導RAW263.7細胞向破骨細胞分化，同時用1×10-6 mol·L-1 ZOL處理；發現ZOL處理組整合素αv、β3 mRNA水平較對照組明顯下降，蛋白水平也分別下降了39.19%和40.17%；免疫熒光檢測也表明，ZOL組整合素αv、β3熒光強度顯著降低，分別下降了37.39%和58.45%。上述結果提示，ZOL可顯著抑制破骨細胞中整合素αv、β3基因表達，從而影響αv、β3在破骨細胞黏附、細胞骨架重排及骨吸收中的作用。結晶紫染色實驗進一步表明，ZOL處理組OD值顯著低于對照組，證實了ZOL對破骨細胞黏附的抑制作用。國外學者[10]應用人成骨細胞作為研究對象，發現ZOL同樣可抑制細胞黏附及整合素αv、β3基因的表達。研究[11]發現，接受雙膦酸鹽長期治療的患者體內存在巨大的破骨細胞，不能貼附于骨組織表面，這也可能與雙膦酸鹽對破骨細胞表面整合素αv、β3的抑制有關。

研究整合素在破骨細胞功能中的作用有極其重要的價值。破骨細胞在骨質疏松、多發性骨髓瘤、骨轉移瘤等多種病理性骨吸收中發揮著重要作用[1]；而其進行骨吸收的前提是通過整合素αv、β3與骨基質表面發生黏附，使細胞骨架重排，形成封閉區和皺褶緣，為骨吸收提供局部微環境[2， 5-6]。臨床前研究表明，整合素αv、β3靶向藥物，如多肽（S247、ATN-

161、cilengitide）及非肽類小分子（PSK1404），均可有效抑制骨吸收及腫瘤骨轉移[12-13]；從而為以整合素αv、β3為靶向進行藥物干預，抑制上述病理狀態下的骨吸收開辟了新途徑。

本研究表明，在體外ZOL可有效地抑制破骨細胞整合素αv、β3的基因表達，降低細胞的黏附能力；ZOL的上述作用可能與其對破骨細胞性骨吸收的抑制有關。

[參考文獻]

[1] Edwards JR， Weivoda MM. Osteoclasts： malefactors of disease and targets for treatment[J]. Discov Med， 2012， 13

（70）：201-210.

[2] Izawa T， Zou W， Chappel JC， et al. c-Src links a RANK/αvβ3 integrin complex to the osteoclast cytoskeleton[J]. Mol Cell Biol， 2012， 32（14）：2943-2953.

[3] Piper PK Jr， Gruntmanis U. Management of osteoporosis in the aging male： focus on zoledronic acid[J]. Clin Interv Aging， 2009， 4：289-303.

[4] 劉強， 董偉， 戚孟春， 等. 阿侖膦酸鹽對破骨細胞生成的抑制及鈣離子激動劑的拮抗效應[J]. 實用口腔醫學雜志， 2012， 28（2）：182-186.

[5] Szabo AM， Howell NR， Pellegrini P， et al. Development and validation of competition binding assays for affinity to the extracellular matrix receptors， αvβ3 and αIIbβ3 integrin[J]. Anal Biochem， 2012， 423（1）：70-77.

[6] Teitelbaum SL. The osteoclast and its unique cytoskeleton

[J]. Ann N Y Acad Sci， 2011， 1240：14-17.

[7] McHugh KP， Hodivala-Dilke K， Zheng MH， et al. Mice lacking beta 3 integrins are osteosclerotic because of dys-functional osteoclasts[J]. J Clin Invest， 2000， 105（4）：433-

440.

[8] Feng X， Novack DV， Faccio R， et al. A Glanzmanns mu-tation in beta 3 integrin specifically impairs osteoclast func-tion[J]. J Clin Invest， 2001， 107（9）：1137-1144.

[9] Faccio R， Novack DV， Zallone A， et al. Dynamic changes in the osteoclast cytoskeleton in response to growth factors and cell attachment are controlled by beta 3 integrin[J]. J Cell Biol， 2003， 162（3）：499-509.

[10] Koch FP， Wunsch A， Merkel C， et al. The influence of bis-phosphonates on human osteoblast migration and integrin avb3/tenascin C gene expression in vitro[J]. Head Face Med， 2011， 7（1）：4.

[11] Weinstein RS， Roberson PK， Manolagas SC. Giant osteoc-last formation and long-term oral bisphosphonate therapy

[J]. N Engl J Med， 2009， 360（1）：53-62.

[12] Clézardin P. Therapeutic targets for bone metastases in breast cancer[J]. Breast Cancer Res， 2011， 13（2）：207.

[13] Cl?zardin P. Integrins in bone metastasis formation and po-tential therapeutic implications[J]. Curr Cancer Drug Targets， 2009， 9（7）：801-806.

（本文采編 石冰）