漆黃素聯(lián)合胡椒堿的抗抑郁作用及其機制研究

王錢東+吳淑娟+朱國文+潘建春

[摘要] 目的 探討低劑量漆黃素（Fisetin）聯(lián)合閾下劑量胡椒堿的抗抑郁作用是否涉及單胺機制。 方法 采用行為絕望抑郁模型，即小鼠強迫游泳實驗和懸尾實驗，觀察低劑量漆黃素與閾下劑量胡椒堿急性給藥對小鼠絕望模型不動時間的影響，同時觀察兩藥聯(lián)用對小鼠自主活動的影響。高效液相-電化學檢測腦區(qū)中單胺遞質(zhì)的含量，熒光分光光度法檢測單胺氧化酶（MAO）活性。 結果 漆黃素（1.25 mg/kg， 2.5 mg/kg， 5 mg/kg， ig）與閾下劑量胡椒堿2.5 mg/kg·ip聯(lián)合應用能顯著減少小鼠強迫游泳和懸尾實驗中的不動時間，且實驗劑量范圍內(nèi)藥物不影響小鼠的自主活動。低劑量漆黃素與閾下劑量胡椒堿合用能升高海馬、皮層和杏仁核中的單胺遞質(zhì)水平同時降低腦內(nèi)的MAO活性，并且具有統(tǒng)計學意義。 結論 低劑量漆黃素與閾下劑量胡椒堿聯(lián)合用藥能改善抑郁癥樣行為，該機制可能是通過抑制單胺氧化酶的活性，從而增加相關的神經(jīng)遞質(zhì)。

[關鍵詞] 漆黃素；胡椒堿；抑郁癥；單胺遞質(zhì)；單胺氧化酶（MAO）

[中圖分類號] R964 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）25-0001-06

抑郁癥會影響身心健康，是一個常見且嚴重的精神障礙。抑郁癥患者目前約占世界人口的21%[1]，其主要癥狀是降低語言功能、運動遲緩等。目前，臨床上使用的抗抑郁藥物主要有三類：單胺氧化酶（MAO）抑制劑，經(jīng)典的三環(huán)類抗抑郁藥藥物，選擇性5-HT重攝取抑制劑5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑[2，3]。因為這些藥物只有約65%的患者有一定的作用，且有藥效不穩(wěn)定、毒副作用大、起效時間長等缺點。因此尋找新型的高效低毒藥物作為抗抑郁的治療非常的重要。

漆黃素（Fisetin，又名非瑟酮）是一種多酚類化合物，其含量在草莓中最高[4]。有文獻報道，漆黃素具有保護和促進神經(jīng)細胞再生作用并且可以改善動物的學習記憶能力[5，6]。此外，C6膠質(zhì)瘤細胞，漆黃素抑制單胺氧化酶（MAO）活性亞型，它可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的腦兒茶酚胺和5 - 羥色胺（5-HT）含量的作用。胡椒堿是胡椒的主要成分，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，目前已經(jīng)有胡椒堿的研究表明，其具有較強的抗抑郁活性，這可能與大腦酶單胺[7]（單胺氧化酶，MAO）的活性有關。文獻報道，胡椒堿能夠通過減慢白藜蘆醇的代謝和延長其在體內(nèi)的時間來增強多酚類化合物白藜蘆醇的生物效應[8]。庫爾卡尼和姜黃素和胡椒堿的其他建議結合能顯著增強姜黃素[9，26]的抗抑郁作用。

本研究首先提出了漆黃素和胡椒堿的聯(lián)合應用，探討其聯(lián)用的抗抑郁機制，同時說明聯(lián)用是否能降低漆黃素的用藥劑量，來達到單用時的效果，從而提高漆黃素的生物利用度，為開發(fā)新一代的高效低毒天然抗抑郁藥物提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

漆黃素和氟西汀均購自美國Sigma公司；嗎氯貝胺購自中國藥品生物制品檢定所。漆黃素、嗎氯貝胺和氟西汀均用蒸餾水溶解，漆黃素和嗎氯貝胺均灌胃給藥，氟西汀腹腔給藥。聯(lián)合用藥的給藥方式為：先灌胃給予漆黃素（1.25 mg/kg， 2.5 mg/kg 和5 mg/kg），45 min后再分別腹腔注射胡椒堿（2.5 mg/kg），15 min后進行測試；在預實驗中，給予胡椒堿和蒸餾水的小鼠在懸尾和強迫游泳不動時間上沒有明顯差異，所以在正式實驗中僅用胡椒堿作為對照組。

1.2實驗儀器

BS-11OS型電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；WH-966漩渦混合器，太倉市科教器材廠；DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Bio-RAD 680酶標儀，美國伯樂公司；RF-5301PC型熒光分光光度計，日本島津公司；JY92-2D超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗動物

雄性ICR小鼠，體質(zhì)量為20～25g，購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心。小鼠隨機分組，8只/籠，室溫（25±1）℃，濕度（50±10）%，自然光照，自由攝食飲水條件下進行實驗。開始實驗之前先適應5d。小鼠隨機分組：正常對照組（Pip 2.5 mg/kg）、聯(lián)合給藥組（Pip 2.5 mg/kg+Fisetin 1.25 mg/kg， 2.5 mg/kg，5 mg/kg ）、氟西汀組（10 mg/kg）和嗎氯貝胺組（20 mg/kg ）。嗎氯貝胺組用于MAO活性的測定。

1.4 小鼠懸尾實驗[10]

小鼠末次給藥后，在小鼠的尾巴末端用醫(yī)用膠帶固定，然后將此懸掛在小鼠懸尾測試儀器中（其懸掛高度為50 cm）。觀察小鼠在6 min內(nèi)的行為并記錄最后4min內(nèi)小鼠的不動時間。小鼠的不動時間標準：小鼠倒掛在儀器中表現(xiàn)為完全不動。

1.5 小鼠強迫游泳實驗[11]

在測試前24h，將小鼠放在一個裝有水的圓形玻璃容器內(nèi)，水的深度為10 cm，水的溫度為24 ℃～25 ℃（圓形玻璃容器的規(guī)格：高25 cm；直徑10 cm）進行強迫游泳訓練，時間為15 min。24 h以后再次給藥，然后將小鼠再次放入玻璃圓缸內(nèi)做強迫游泳6 min，觀察并記錄后4 min小鼠的強迫游泳的不動時間。不動時間的標準為：小鼠停止掙扎浮在水中保持不動，或僅僅做一些必要的輕微動作保持頭部浮在水面上。

1.6 小鼠自發(fā)活動[12]

小鼠末次給藥以后，將小鼠放進自主活動箱的測定小室里，先適應5min，然后紀錄小鼠在活動室的活動情況，記錄時間為10 min。小鼠自發(fā)活動的記錄標準：小鼠的爪子接觸或離開底部的不銹鋼橫柵時產(chǎn)生的與小鼠自主活動成比例的電脈沖，這些電脈沖直接轉(zhuǎn)換成小鼠的活動次數(shù)顯示在數(shù)據(jù)窗中。

1.7 小鼠腦內(nèi)單胺遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量測定[13]

給藥后（漆黃素， ig；氟西汀或胡椒堿， ip），將小鼠快速斷頭處死，按照小鼠腦圖譜在冰板上迅速分離出雙側(cè)的海馬、額葉皮層和杏仁核，稱重后放入-80℃冰箱中保存。按照每100 mg腦組織中加入200 μL冰冷的 0.4 mol/L HClO4溶液（溶液A），然后在冰上進行超聲勻漿，接著4℃暗處靜置60min，低溫快速離心20 min（12，000 rpm，4 ℃），取上清液，加入上清液1/2量體積的B液，混勻，4℃暗處靜置60 min，再次低溫高速離心20 min（12，000 rpm，4℃），丟棄沉淀。樣品上清液經(jīng)過濾器過濾處理后（過濾器的孔徑大小為0.22 μm），取20 μL自動進樣。本實驗采用的色譜柱為Diamonsilim C18（規(guī)格：150 mm×4.6 mm ID， 5 μm），流動相配方：125 mmol/L 枸櫞酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH = 4.3）0.1 mmol/L EDTA， 1.2 mmol/L辛烷基磺酸鈉，16%甲醇。流動相配置：按照以上的流動相配方稱取藥品，放入容器中，溶解均勻后用容量瓶定容，然后用0.22μm濾膜過濾，超聲20 min后進行實驗。流動相的流速為1.0 mL/min 。采用電化學檢測器進行檢測，腦組織中單胺及其代謝產(chǎn)物的含量以ng/g 濕組織重表示。

1.8 小鼠單胺氧化酶活性的測定[13]

小鼠末次給藥以后快速斷頭處死，分離出腦組織，然后稱重放入EP管中，將此EP管插入小碎冰里，接著在EP管中加入冰冷的4 mL磷酸緩沖液（pH = 7.8， 0.05 mol/L ），防止組織里單胺氧化酶活性降解，所有的操作都必須在冰上操作。然后在冰上進行勻漿制成腦組織勻漿液，接著在2.5mL磷酸緩沖液中加入20%曲通0.4 mL與組織勻漿液0.2 mL，渦旋器混勻，然后在38 ℃孵育箱中預孵育10 min， 加入30 μL 2.19 mmol/L 底物（終濃度為22 μmol/L），37 ℃孵育箱中孵育30 min，再加入0.2 mL 5 mol/L 高氯酸溶液，冷卻后并離心（1500× g，10 min），取出0.5 mL上清液，然后加入濃度為1 mol/L 氫氧化鈉溶液 2.5 mL，混勻并使用熒光分光光度計測定產(chǎn)物4-氫喹啉的熒光強度。單胺氧化酶的活性以nmol/（30min ·mg） protein表示。本實驗中的組織蛋白濃度采用Bradford法來測定。

1.9 統(tǒng)計學處理方法

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，藥物作用及其組間差異采用單因素方差（One-way ANOVA）方法分析中的Dunnett t檢驗分析，當P < 0.05時 視為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 漆黃素和胡椒堿聯(lián)合用藥在小鼠懸尾實驗中的作用

結果圖1顯示，與空白對照組相比，小鼠懸尾實驗中漆黃素和胡椒堿聯(lián)合用藥組（Pip + Fisetin 1.25 mg/kg，2.5 mg/kg，5 mg/kg，）可以減少小鼠懸尾實驗中的不動時間，具有統(tǒng)計學意義[F（4，35）=3.361，P=0.02<0.05 ]。陽性對照藥氟西汀組能顯著減少不動時間。

2.2 漆黃素和胡椒堿聯(lián)合用藥在小鼠強迫游泳實驗中的作用

結果如圖2顯示，在強迫游泳實驗中，與空白對照組相比，漆黃素和胡椒堿聯(lián)合用藥組（Pip+Fisetin 1.25 mg/kg，2.5 mg/kg，5 mg/kg ）可以減少小鼠強迫游泳實驗中的不動時間，具有統(tǒng)計學意義[F（4，35）=3.794，P=0.011<0.05]。其作用效果與陽性對照樣氟西汀相似。

2.3漆黃素和胡椒堿聯(lián)合用藥在小鼠自發(fā)活動中的作用

實驗結果如圖3所示，與空白對照組相比，在自發(fā)活動中，漆黃素和胡椒堿聯(lián)合給藥組（Pip+ Fisetin1.25 mg/kg，2.5 mg/kg，5 mg/kg）沒有明顯差異，從這個結果得出可以排除藥物的假陽性結果。

2.4 小鼠腦內(nèi)單胺遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量的變化

如表1所示，在小鼠海馬中，與空白對照組相比，漆黃素和胡椒堿聯(lián)合用藥組（Pip + Fisetin 2.5 mg/kg， Pip + Fisetin 5 mg/kg，ig）和氟西汀組（10 mg/kg， ip）均增加海馬中5-HT的含量，具有統(tǒng)計學意義[F（4，35）=5.170， P=0.0006<0.01]；去甲腎上腺素水平也增加，具有統(tǒng)計學意義[F（4，35）=4.312，P=0.002<0.01] 。

如表2所示，在額葉皮層中，與空白對照組相比，漆黃素和胡椒堿聯(lián)合用藥組（Pip + Fisetin 2.5 mg/kg ， Pip + Fisetin 5 mg/kg， ig）和氟西汀組（10 mg/kg， ip）增加5-HT的含量，具有統(tǒng)計學意義[F（4，35）=3.968， P=0.036<0.05]；去甲腎上腺素水平也增加，具有統(tǒng)計學意義[F（4，35）=3.411， P=0.04<0.05）]。

如表3所示，在杏仁核中，與空白對照組相比，漆黃素和胡椒堿聯(lián)合用藥組（Pip + Fisetin 2.5 mg/kg， Pip + Fisetin 5 mg/kg，ig）和氟西汀組（10 mg/kg，ip）均增加5-HT的含量，具有統(tǒng)計學意義[F（4，35）=4.668， P=0.002<0.01 ]；去甲腎上腺素水平也增加，具有統(tǒng)計學意義[F（4，35）=3.156， P=0.014<0.05] 。

2.5 漆黃素和胡椒堿聯(lián)合用藥對小鼠單胺氧化酶活性的影響

結果如表4所示，與空白對照組相比，漆黃素和胡椒堿聯(lián)合用藥組（Pip + Fisetin1.25 mg/kg，2.5 mg/kg，5 mg/kg）能夠抑制單胺氧化酶A的活性，并且具有統(tǒng)計學意義[F（4，35）=4.199，P=0.0028<0.01] ，但是對單胺氧化酶B沒有作用。此結果和單胺氧化酶A抑制劑嗎氯貝胺的作用相似。

3討論

許多研究表明，抑郁癥具有一定的遺傳性，臨床研究顯示大概40%～50%抑郁癥患者來源于基因的遺傳，但是抑郁癥發(fā)病機制復雜，其涉及到機體交感神經(jīng)、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等多個方面。目前研究表明通過藥物的聯(lián)合應用來治療抑郁癥具有以下優(yōu)勢：減少藥物臨床不良反應，戒斷綜合征[14，15]以及對心理的傷害作用，快速地提高藥物療效。本研究從2011年1月～2013年12月份采用漆黃素和胡椒堿的聯(lián)合應用，從行為學、分子生物學的角度來闡明聯(lián)合用藥的藥理效應及其作用靶點。

當人類處于無法改變的惡劣環(huán)境條件下，抑郁癥患者更加傾向于表現(xiàn)出消極狀態(tài)。在抗抑郁樣作用的研究中，行為學實驗具有重要的作用，小鼠懸尾實驗和小鼠強迫游泳實驗是評價抑郁樣行為的經(jīng)典模型，通過觀察其不動時間可以確定藥物的抗抑郁樣效應并且確定其作用靶標[16，17]。本實驗的結果表明，漆黃素與胡椒堿聯(lián)合應用能顯著減少小鼠在懸尾實驗（TST）和強迫游泳實驗（FST）的不動時間，說明漆黃素和胡椒堿聯(lián)合應用具有抗抑郁樣作用。并且本實驗發(fā)現(xiàn)與單用各個劑量的漆黃素相比，本研究中結果未顯示，Pip 2.5 mg/kg+Fisetin 5 mg/kg的聯(lián)合應用與單用Fisetin（20 mg/kg）的抗抑郁樣行為效果相當，說明閾下劑量的胡椒堿能增強漆黃素的抗抑郁活性。同時，為排除藥物中樞興奮作用造成的假陽性結果，本研究觀察了漆黃素和胡椒堿的聯(lián)合應用對小鼠自主活動的影響。結果顯示，在產(chǎn)生抗抑郁樣作用的劑量范圍內(nèi)，該聯(lián)合用藥對小鼠自主活動次數(shù)沒有明顯影響，可排除假陽性的結果，進一步證實漆黃素和胡椒堿聯(lián)合用藥的抗抑郁作用。

大量研究表明，抑郁癥患者體內(nèi)5-羥色胺和兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)的降解增加，從而在體內(nèi)的表達減少。現(xiàn)代神經(jīng)生物學的近期研究發(fā)現(xiàn)，應激誘導的大鼠抑郁模型中額葉皮層體積的縮小和突觸相關蛋白表達的減少與腦區(qū)中5-HT及5-HT受體的異常密切相關[18]。另外，一些抑郁癥的表現(xiàn)如對于主動或者積極應對的行為減少以及被動或者消極應對的行為增加，這些表現(xiàn)與去甲腎上腺素（NE）和5-羥色胺（5-HT）的含量密切相關。5-HT是人體內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，其在生理和病理過程中具有重要的作用，如調(diào)節(jié)情緒、學習、睡眠和性行為等，這些在重型的抑郁癥患者中都能表現(xiàn)出異常特征。另外，慢性應激引起的抑郁樣行為學的改變（認知和行為發(fā)生障礙）與腦內(nèi)5-HT神經(jīng)遞質(zhì)的變化密切相關[19]。文獻報道通過減少腦區(qū)內(nèi)5-HT的降解，激動5-HT受體，提高胞內(nèi)AC-cAMP的活性和CREB活性具有改善抑郁樣的作用[20]，因此5-HT在發(fā)揮抗抑郁樣作用中具有重要的作用。前期研究表明漆黃素可以通過抑制單胺氧化酶活性來增加腦內(nèi)的單胺遞質(zhì)水平，從而來改善抑郁樣行為學的改變[21]。但是漆黃素的生物活性比較低，同時胡椒堿是一種生物活性增強劑，能提高其他藥物的生物利用度。因此本實驗通過觀察腦區(qū)的單胺遞質(zhì)水平的變化來尋找其聯(lián)合用藥的作用靶標，結果發(fā)現(xiàn)，低劑量漆黃素（2.5 mg/kg和5 mg/kg）與閾下劑量胡椒堿合用能劑量依賴性提高小鼠海馬、額葉皮層和杏仁核的5-HT水平，這與陽性對照藥氟西汀的結果相似；漆黃素（5 mg/kg）與閾下劑量胡椒堿合用后可增加該三個腦區(qū)中去甲腎上腺素（NE）的含量。研究表明，海馬、額葉皮層和杏仁核中單胺遞質(zhì)的變化與動物的情感、動機、學習和記憶行為有密切關系[22]。如今采用的傳統(tǒng)的抗抑郁藥是通過抑制神經(jīng)遞質(zhì)再攝取或減少其降解從而增加去甲腎上腺素的含量。基于行為學和單胺遞質(zhì)的結果，漆黃素與胡椒堿的協(xié)同作用可能是通過腦內(nèi)單胺遞質(zhì)（去甲腎上腺素和5-羥色胺）代謝的調(diào)節(jié)，從而來拮抗抑郁癥的發(fā)生。這個與目前研究較多的5-羥色胺和去甲腎上腺素重吸收抑制劑或者選擇性5-羥色胺或去甲腎上腺素重吸收抑制劑的機制相似，都是通過增加腦內(nèi)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平來改善抑郁癥狀。

改善抑郁癥除了可以通過增加突觸內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)水平，也可以通過抑制單胺氧化酶來增加突觸間隙中的神經(jīng)遞質(zhì)含量。單胺氧化酶是一類可以催化降解單胺神經(jīng)遞質(zhì)如5-羥色胺，去甲腎上腺素和多巴胺的線粒體結合同工酶[23]。根據(jù)底物的特異性和對抑制劑的敏感性單胺氧化酶可以分為MAO-A和MAO-B兩類。其中單胺氧化酶-A主要是代謝腦區(qū)內(nèi)與抑郁密切相關的去甲腎上腺素和5-羥色胺，單胺氧化酶-B主要是代謝多巴胺和去甲腎上腺素[24]。目前臨床上抗抑郁藥物基本上是通過抑制單胺氧化酶的活性（如嗎氯貝胺）和增加中樞神經(jīng)遞質(zhì)水平（如丙咪嗪）來達到抗抑郁作用的[25]。然而單胺氧化酶抑制劑比三環(huán)類抗抑郁藥（丙咪嗪）的效果更好。為了證實漆黃素和胡椒堿的聯(lián)合用藥是否通過抑制單胺氧化酶的活性來增加中樞突觸內(nèi)的單胺遞質(zhì)水平，本實驗測定了用藥后腦組織的單胺氧化酶活性。結果發(fā)現(xiàn)，漆黃素與閾下劑量胡椒堿聯(lián)合用藥能夠抑制單胺氧化酶-A的活性，這與各個腦區(qū)中單胺遞質(zhì)水平的變化一致。與單胺氧化酶A不同，漆黃素與胡椒堿的聯(lián)合應用對MAO-B的活性沒有太大的影響。以上對單胺氧化酶活性的作用與陽性對照藥嗎氯貝胺的作用結果相似。進一步說明了漆黃素與胡椒堿聯(lián)合應用可能是通過抑制腦內(nèi)單胺氧酶的活性來增加腦內(nèi)突觸中單胺遞質(zhì)的水平來改善抑郁樣行為學。此外，新型的選擇性MAO-AB抑制劑如TV-3326具有抗抑郁樣作用，但是不會產(chǎn)生“奶酪”反應（例如，急性高血壓和頭痛）。說明單胺氧化酶抑制劑為治療抑郁癥提供了良好的作用效果。

在小鼠強迫游泳和小鼠懸尾實驗中發(fā)現(xiàn)漆黃素和閾下劑量的胡椒堿聯(lián)合應用具有明顯的抗抑郁樣作用，該作用可能與中樞單胺能神經(jīng)系統(tǒng)有關。本研究發(fā)現(xiàn)漆黃素和胡椒堿的聯(lián)合使用可能是通過抑制MAO-A活性來調(diào)節(jié)腦內(nèi)5-羥色胺和去甲腎上腺素的遞質(zhì)代謝來發(fā)揮抗抑郁樣作用。由此，通過聯(lián)合使用胡椒堿增加漆黃素的藥理效果，為減少藥物的毒副作用，開發(fā)新型高效的天然抗抑郁藥提供了新的思路，后續(xù)的研究將進一步從機制通路來表明其抗抑郁樣作用，并尋找新的藥物作用靶點。

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（收稿日期：2014-05-07）

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（收稿日期：2014-05-07）