阿霉素加熱化療對人肝癌細胞HHCC及HepG2的抑制作用研究

侯敬申+侯敬俠+王偉雄+等

[摘要] 目的 探討阿霉素加熱化療對人肝癌細胞HHCC及HepG2的抑制作用。方法 選擇體外培養對數生長期HHCC及HepG2細胞為研究對象，采用10%胎牛血清培養液配制成細胞密度5×104/mL的單細胞懸液，接種于50mL的培養瓶中，細胞分為3組，分別進行單純加熱、單純化療、加熱化療處理；采用MTT法檢測細胞增殖抑制率，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。 結果 HHCC及HepG2細胞增殖抑制率3組間比較，差異有統計學意義（P<0.05）；加熱化療組細胞增殖抑制率明顯高于單純加熱組及單純化療組（P<0.05）；HHCC及HepG2細胞凋亡率三組間差異有統計學意義（P<0.05），加熱化療組細胞凋亡率明顯高于單純加熱組及單純化療組（P<0.05）。 結論 加熱化療可明顯增強阿霉素對人肝癌細胞HHCC及HepG2的增殖抑制作用，對臨床治療有借鑒意義。

[關鍵詞] 阿霉素；熱化療；人肝癌細胞；細胞增殖

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）12-11-03

原發性肝癌是我國常見的惡腫瘤之一，在惡性

腫瘤死亡順位中占第2位，其致死率在城市人群中僅次于肺癌；農村人群中僅次于胃癌。但是原發性肝癌早期癥狀不明顯，臨床出現典型癥狀時大多處于晚期，且病情進展較快，治療難度較大，術后容易復發，或喪失手術機會，患者短期內死亡[1]。因此提高肝癌尤其是晚期肝癌的藥物治療水平對改善患者病情，延長患者生存期有重要意義。熱療是近年興起的一種新的腫瘤治療方法，大量臨床研究顯示熱療對化療或放療有明顯的增效作用，部分腫瘤患者熱化療后其完全緩解率可提高1倍左右[2]。本文研究加熱化療對人肝癌細胞HHCC及HepG2的抑制作用，為肝癌的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

肝癌HHCC及HepG2細胞由本院腫瘤實驗室提供，采用含10%牛血清的培養液保存。阿霉素購自輝瑞制藥有限公司，多孔細胞培養板購自上海研拓生物科技有限公司，電熱恒溫水浴箱購自蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HHCC及HepG2細胞均采用含10%牛血清的DMEM培養液培養，取對數生長期細胞進行試驗，用10%胎牛血清培養液配制成細胞密度5×104/mL的單細胞懸液，接種于50mL培養瓶中。根據相關文獻研究顯示阿霉素作用于HHCC細胞及HepG2細胞時24h IC50的藥物濃度分別為7.0mg/L，2.0mg/L[3]，本文以此濃度為實驗濃度。熱化療組及化療組HHCC及HepG2細胞培養瓶中加入對應濃度的阿霉素，單純熱療組培養瓶加入等量空白對照液；化療組放入37℃，5%CO2培養箱中繼續培養，而熱化療組及單純熱療組放入電熱恒溫水浴箱進行加熱，溫度設定為43℃，上下浮動不超過0.1℃，加熱時間為60min，加熱后繼續放入培養箱中培養24h。

1.2.2 細胞增殖抑制率測定（MTT法） 取常規對數生長期細胞（對照組）及經過上述處理的細胞（實驗組），制成單細胞懸液，調整細胞密度為2.5×105/mL，接種于96孔培養板中，每孔200μL，每孔加入MTT 20μL，繼續培養4h后取出培養板，棄MTT液，每孔加入DMSO 150μL，微量震蕩后，將培養板置于全自動酶標儀，測定每孔OD值，以（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值測定細胞增殖抑制率。

1.2.3 細胞凋亡率測定 各組細胞經處理后，取樣，配置細胞懸液，細胞密度5×105/mL，取1mL，采用PBS溶液洗滌2次后加入Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑，避光保存1h后，采用流式細胞儀檢測細胞數，以Cell quest軟件計算細胞凋亡率。

1.3 統計學方法

數據采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，數據以（）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

3 討論

熱療是近年興起的一種新的腫瘤治療方法，大量臨床研究顯示熱療對化療或放療有明顯的增效作用，部分腫瘤患者熱化療后其完全緩解率可提高1倍左右。德國醫學專家2009年的一項研究結果表明，在治療癌癥患者時使用熱療和化療相結合的方法比單一接受化療效果更好，無瘤期更長[4]。但是加熱與化療聯合作用的具體機制尚未完全明確，加熱本身會影響藥物代謝動力學及腫瘤局部血流分布情況，并且不同加熱溫度及化療劑量會對腫瘤細胞生長造成不同影響[5]。

目前研究認為熱療對腫瘤細胞的抑制作用與熱療穩定及作用時間有關，而化療對腫瘤的抑制作用主要與藥物劑量有關。對于某種特定的藥物而言，熱療與化療的協同作用主要體現在以下幾個方面：（1）熱療能夠腫瘤內部血流灌注，同時損害腫瘤細胞膜的穩定性，導致腫瘤內部血液內藥物含量增加，同時由于細胞膜穩定性降低，藥物更容易進入腫瘤細胞內，發揮殺滅作用[6]。（2）熱療能夠改變腫瘤細胞外部環境，使外部pH降低，腫瘤細胞對化療的敏感性增加，并且pH降低利于化療藥物對腫瘤細胞的直接損傷[7-8]；（3）對于部分熱敏感性細胞，熱療能直接導致一部分腫瘤細胞DNA或RNA損傷。

阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用；其主要機制是抑制腫瘤細胞DNA復制過程，導致細胞死亡或分裂停滯[9-14]。本研究結果顯示單純化療或熱療對肝癌HHCC及HepG2細胞均有一定程度的抑制作用，但是加熱化療組HHCC及HepG2細胞增殖抑制率、凋亡率明顯高于上述兩組，說明熱療與化療在抑制HHCC及HepG2細胞增殖方面有明顯的協同作用。endprint

綜上所述，加熱化療可明顯增強阿霉素對人肝癌細胞HHCC及HepG2的增殖抑制作用，對臨床治療有借鑒意義；但是如何選擇最佳加熱溫度與化療藥物劑量的選擇使患者受益最大還需要進一步研究。

[參考文獻]

[1] 張洪新，劉燕，王執民，等.阿霉素加熱化療對抗人肝癌耐藥細胞多藥耐藥性的實驗研究[J].腫瘤防治研究，2001，28（3）：170-172.

[2] 仲飛，向美煥，楊靜.阿霉素熱化療對肝癌細胞及其耐藥株凋亡的影響與機制[J].實用癌癥雜志，2006，21（6）：570-572，593.

[3] 劉寶瑞，楊覓.惡性腫瘤的熱化療與熱靶化療[J].實用臨床醫藥雜志，2005，9（5）：1.

[4] 張蓓，劉志蘇，孫權，等.全身性熱化療誘導肝癌細胞凋亡及其機制的探討[J].臨床外科雜志，2005，13（4）：226-227.

[5] 劉寶瑞，錢曉萍.腫瘤熱化療的基礎與臨床研究進展[J].國外醫學（腫瘤學分冊），2004，31（1）：34.

[6] 張力，龔明玉，李毅學，等.放療聯合熱療誘導肝癌HepG2細胞凋亡及其與Bcl-2和Bax蛋白表達關系的研究[J].中國全科醫學，2011，14（6）：126.

[7] 魏紅梅，郭坤元，梅家轉，等.熱化療對Raji細胞體外增敏作用的實驗研究[J].南方醫科大學學報，2007，27（5）：709-711.

[8] 王倩榮，史正華，馬驥，等.阿霉素熱化療對肝癌細胞增殖和凋亡的影響[J].現代腫瘤醫學，2011，19（10）：1918-1922.

[9] 張洪新，郭衛平，王執民，等.阿霉素化療與熱化療對人肝癌細胞耐藥模型作用的比較[J].第四軍醫大學學報，2000，21（8）：964-967.

[10] 張顯忠，郭愛軍，廉立慧，等.PI3K/mTOR抑制劑BEZ235抑制HepG2細胞增殖及與阿霉素的協同效應[J].中國藥理學通報，2012，28（2）：185-189.

[11] 王章桂，孫國平，徐淑萍，等.丹皮酚聯合阿霉素對HepG2細胞株的增殖抑制作用[J].腫瘤防治研究，2008，35（6）：386-389.

[12] 史衛紅，卞勇華，宋祥和，等.索拉菲尼聯合阿霉素對人肝癌細胞株HepG2的抑制作用[J].現代生物醫學進展，2011，11（24）：4845-4848

[13] 鄧立力，呂慧芳，王文秀，等.阿霉素聯合TRAIL對人肝癌細胞增殖與TRAIL受體表達的影響[J].臨床腫瘤學雜志，2012，17（2）：102-106

[14] 蔣杰，宋春明，李建華，等.蘆薈大黃素、阿霉素聯合應用對肝癌HepG2細胞增殖的影響[J].湖北民族學院學報（醫學版），2009，26（4）：17-19

（收稿日期：2014-03-30）endprint

綜上所述，加熱化療可明顯增強阿霉素對人肝癌細胞HHCC及HepG2的增殖抑制作用，對臨床治療有借鑒意義；但是如何選擇最佳加熱溫度與化療藥物劑量的選擇使患者受益最大還需要進一步研究。

[參考文獻]

[1] 張洪新，劉燕，王執民，等.阿霉素加熱化療對抗人肝癌耐藥細胞多藥耐藥性的實驗研究[J].腫瘤防治研究，2001，28（3）：170-172.

[2] 仲飛，向美煥，楊靜.阿霉素熱化療對肝癌細胞及其耐藥株凋亡的影響與機制[J].實用癌癥雜志，2006，21（6）：570-572，593.

[3] 劉寶瑞，楊覓.惡性腫瘤的熱化療與熱靶化療[J].實用臨床醫藥雜志，2005，9（5）：1.

[4] 張蓓，劉志蘇，孫權，等.全身性熱化療誘導肝癌細胞凋亡及其機制的探討[J].臨床外科雜志，2005，13（4）：226-227.

[5] 劉寶瑞，錢曉萍.腫瘤熱化療的基礎與臨床研究進展[J].國外醫學（腫瘤學分冊），2004，31（1）：34.

[6] 張力，龔明玉，李毅學，等.放療聯合熱療誘導肝癌HepG2細胞凋亡及其與Bcl-2和Bax蛋白表達關系的研究[J].中國全科醫學，2011，14（6）：126.

[7] 魏紅梅，郭坤元，梅家轉，等.熱化療對Raji細胞體外增敏作用的實驗研究[J].南方醫科大學學報，2007，27（5）：709-711.

[8] 王倩榮，史正華，馬驥，等.阿霉素熱化療對肝癌細胞增殖和凋亡的影響[J].現代腫瘤醫學，2011，19（10）：1918-1922.

[9] 張洪新，郭衛平，王執民，等.阿霉素化療與熱化療對人肝癌細胞耐藥模型作用的比較[J].第四軍醫大學學報，2000，21（8）：964-967.

[10] 張顯忠，郭愛軍，廉立慧，等.PI3K/mTOR抑制劑BEZ235抑制HepG2細胞增殖及與阿霉素的協同效應[J].中國藥理學通報，2012，28（2）：185-189.

[11] 王章桂，孫國平，徐淑萍，等.丹皮酚聯合阿霉素對HepG2細胞株的增殖抑制作用[J].腫瘤防治研究，2008，35（6）：386-389.

[12] 史衛紅，卞勇華，宋祥和，等.索拉菲尼聯合阿霉素對人肝癌細胞株HepG2的抑制作用[J].現代生物醫學進展，2011，11（24）：4845-4848

[13] 鄧立力，呂慧芳，王文秀，等.阿霉素聯合TRAIL對人肝癌細胞增殖與TRAIL受體表達的影響[J].臨床腫瘤學雜志，2012，17（2）：102-106

[14] 蔣杰，宋春明，李建華，等.蘆薈大黃素、阿霉素聯合應用對肝癌HepG2細胞增殖的影響[J].湖北民族學院學報（醫學版），2009，26（4）：17-19

（收稿日期：2014-03-30）endprint

綜上所述，加熱化療可明顯增強阿霉素對人肝癌細胞HHCC及HepG2的增殖抑制作用，對臨床治療有借鑒意義；但是如何選擇最佳加熱溫度與化療藥物劑量的選擇使患者受益最大還需要進一步研究。

[參考文獻]

[1] 張洪新，劉燕，王執民，等.阿霉素加熱化療對抗人肝癌耐藥細胞多藥耐藥性的實驗研究[J].腫瘤防治研究，2001，28（3）：170-172.

[2] 仲飛，向美煥，楊靜.阿霉素熱化療對肝癌細胞及其耐藥株凋亡的影響與機制[J].實用癌癥雜志，2006，21（6）：570-572，593.

[3] 劉寶瑞，楊覓.惡性腫瘤的熱化療與熱靶化療[J].實用臨床醫藥雜志，2005，9（5）：1.

[4] 張蓓，劉志蘇，孫權，等.全身性熱化療誘導肝癌細胞凋亡及其機制的探討[J].臨床外科雜志，2005，13（4）：226-227.

[5] 劉寶瑞，錢曉萍.腫瘤熱化療的基礎與臨床研究進展[J].國外醫學（腫瘤學分冊），2004，31（1）：34.

[6] 張力，龔明玉，李毅學，等.放療聯合熱療誘導肝癌HepG2細胞凋亡及其與Bcl-2和Bax蛋白表達關系的研究[J].中國全科醫學，2011，14（6）：126.

[7] 魏紅梅，郭坤元，梅家轉，等.熱化療對Raji細胞體外增敏作用的實驗研究[J].南方醫科大學學報，2007，27（5）：709-711.

[8] 王倩榮，史正華，馬驥，等.阿霉素熱化療對肝癌細胞增殖和凋亡的影響[J].現代腫瘤醫學，2011，19（10）：1918-1922.

[9] 張洪新，郭衛平，王執民，等.阿霉素化療與熱化療對人肝癌細胞耐藥模型作用的比較[J].第四軍醫大學學報，2000，21（8）：964-967.

[10] 張顯忠，郭愛軍，廉立慧，等.PI3K/mTOR抑制劑BEZ235抑制HepG2細胞增殖及與阿霉素的協同效應[J].中國藥理學通報，2012，28（2）：185-189.

[11] 王章桂，孫國平，徐淑萍，等.丹皮酚聯合阿霉素對HepG2細胞株的增殖抑制作用[J].腫瘤防治研究，2008，35（6）：386-389.

[12] 史衛紅，卞勇華，宋祥和，等.索拉菲尼聯合阿霉素對人肝癌細胞株HepG2的抑制作用[J].現代生物醫學進展，2011，11（24）：4845-4848

[13] 鄧立力，呂慧芳，王文秀，等.阿霉素聯合TRAIL對人肝癌細胞增殖與TRAIL受體表達的影響[J].臨床腫瘤學雜志，2012，17（2）：102-106

[14] 蔣杰，宋春明，李建華，等.蘆薈大黃素、阿霉素聯合應用對肝癌HepG2細胞增殖的影響[J].湖北民族學院學報（醫學版），2009，26（4）：17-19

（收稿日期：2014-03-30）endprint