腸內免疫微生態營養對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障功能的保護作用

康利民，潘明新，高 毅，王康華，洪 合

（南方醫科大學珠江醫院肝膽二科，廣州510280）

重癥急性胰腺炎（server acute pancreatitis，SAP）的死亡高峰主要是壞死的胰腺組織引起的繼發感染。繼發感染主要源于SAP腸黏膜屏障破壞引起的細菌易位［1］。動物及臨床研究已經證實，腸內營養（enteral nutrition，EN）支持對SAP腸屏障功能的保護作用［2－3］。腸內免疫微生態營養（ecoimmunonutrition，EIN）支持是近年來發展起來的一種新方式，本實驗探討EIN對SAP大鼠腸黏膜屏障的保護作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級健康雄性SD大鼠60只（購自南方醫科大學實驗動物中心），體質量260～300g，分為對照組、EN組和EIN組，每組20只。采用逆行胰膽管緩慢注入4%牛黃膽酸鈉1mL／kg體質量的方法制備SAP模型，對照組開腹后翻動胰腺數次。SAP模型大鼠另選取空腸起始部約2 cm以下行空腸造口置入造瘺管并經皮下隧道引出體外。

1.2 方法

1.2.1 方法 EN組：待大鼠清醒后4h，用少量等滲鹽水沖洗腸管，6h起腸道滴注腸內營養乳劑（華瑞公司生產），各組大鼠能量攝入126kJ·kg－1·d－1。EIN組：在EN組腸內營養乳劑中加入谷氨酰胺（L－Gln，成都藥業股份有限公司）0.4g·kg－1·d－1、精氨酸（L－Arg，上海信誼制藥廠）0.25g·kg－1·d－1、三聯活菌制劑（雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌及腸球菌，上海信誼制藥廠）109CFU／d。對照組正常飲食、飲水。3組大鼠7d后經腹腔麻醉處死，心臟取血備用。取胰腺、空腸甲醛及戊二醛固定保存備用。

1.2.2 檢測指標及方法 血清淀粉酶采用全自動生化儀測定；血漿內毒素測定采用動態比濁法，內毒素檢測用水購自天津一瑞生物工程有限公司；D－乳酸采用酶學分光光度法檢測，D－乳酸標準液及右旋乳酸脫氫酶（D－LDH）購自Sigma公司；二胺氧化酶（DAO）采用活性比色法測定，檢測試劑盒購自上海杰美基因醫藥有限公司；取胰腺及距幽門10cm處小腸約2 cm，常規甲醛固定光鏡病理檢查，測20個小腸絨毛的絨毛高度并計算小腸黏膜厚度。參照文獻［4］將小腸黏膜損傷分為6級，比較3組小腸病理學評分；另取約2cm小腸，2.5%戊二醛溶液固定并乙醇脫水，環氧樹脂包埋，亞甲藍染色光鏡下定位后，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，JEM－200EX（JEOL公司）透射電鏡下觀察并攝片。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料以表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 動物存活情況 實驗過程中，EN組有3只大鼠分別于術后45min、16h、4d死亡，EIN組1只大鼠于術后3d死亡，以上4只大鼠實驗數據未進入統計。

2.2 血清淀粉酶、內毒素、D－乳酸及DAO水平變化EN組、EIN組血清淀粉酶、內毒素、D－乳酸及DAO水平均明顯高于對照組（P＜0.01）；EIN組內毒素、D－乳酸及DAO水平較EN組明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），兩組血清淀粉酶無明顯差異，見表1。

2.3 胰腺和小腸組織病理學變化 對照組胰腺小葉結構完整無明顯改變；EN組胰腺組織出血、壞死，腺體結構消失，炎性細胞浸潤和胰周組織脂肪壞死；EIN組可見胰腺小葉結構欠完整，輕度水腫、出血，組織間隙略增寬，少量炎性細胞浸潤（圖1）；對照組空腸黏膜完整，空腸絨毛無水腫，排列整齊；EN組空腸黏膜上皮糜爛，大片壞死，脫落及缺損，大量炎癥細胞浸潤，絨毛樣結構減少；EIN組空腸黏膜表現輕度水腫，片狀壞死，絨毛部分脫落及倒伏，見圖2。

表1 血清淀粉酶、內毒素、D－乳酸及DAO水平比較±s）

表1 血清淀粉酶、內毒素、D－乳酸及DAO水平比較±s）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與 EN 組比較。

組別 n 淀粉酶（IU／L）內毒素（pg／L）D－乳酸（μg／mL）DAO（μg／mL）150±35 7.91±2.13 3.94±1.17 14.27±2.53 EN組 17 1 629±91a41.45±3.27a11.35±1.34a81.27±3.46a EIN組 19 1 521±87a18.57±2.51ab 6.64±1.47ab 21.67±6.72對照組 20 ac

圖1 各組大鼠胰腺病理學變化（HE×100）

圖2 各組大鼠腸道病理學變化（HE×100）

2.4 小腸黏膜厚度、絨毛高度及腸上皮損傷指數的變化 EN組、EIN組大鼠小腸黏膜厚度和絨毛高度均較對照組明顯降低（P＜0.01），小腸上皮損傷指數較對照組明顯增加（P＜0.01）；EIN組小腸黏膜厚度和絨毛高度較EN組顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），而小腸上皮損傷指數較EN組明顯減低（P＜0.01），見表2。

表2 小腸黏膜厚度、絨毛高度計腸上皮損傷指數比較±s）

表2 小腸黏膜厚度、絨毛高度計腸上皮損傷指數比較±s）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與 EN 組比較。

組別 n 黏膜厚度（μm） 絨毛高度（μm）20 669.78±63.51 37.29±5.92 0.82±0.31 EN組 17 369.37±28.52a16.43±4.73a 3.95±0.74a EIN組 19 486.30±37.28ab 21.47±3.60ac 2.81±0.36腸上皮損傷指數對照組ab

圖3 各組大鼠腸道電鏡變化（×10 000）

2.5 小腸組織電鏡結構變化 電鏡觀察下對照組小腸黏膜上皮細胞表面微絨毛排列整齊，柱狀上皮細胞結構完整，細胞質內細胞器豐富，結構未見異常，固有層腺體結構及各種細胞結構正常；EN組小腸黏膜線粒體高度腫脹，嵴缺失，內質網腫脹，上皮細胞微絨毛稀疏、部分缺如，細胞萎縮，大量細胞核濃縮，染色質邊聚；EIN組小腸黏膜上皮細胞表面微絨毛排列有輕度線粒體、內質網腫脹，上皮細胞微絨毛排列略不規整，見圖3。

3 討 論

近年來的研究表明，腸道不僅是消化吸收的重要場所，同時也是急性應激反應的中心器官及多器官功能衰竭的始動器管［5］。腸道作為體內最大的細菌和內毒素庫，腸黏膜屏障功能的完整性對抵抗腸源性細菌易位具有重要的作用。腸道細菌易位導致的胰腺壞死繼發感染是SAP的主要死因之一。所以探索維持腸道黏膜結構和功能的有效方法是目前SAP研究的熱點之一。

腸黏膜屏障主要由機械屏障、免疫屏障、生物屏障及化學屏障4部分組成，而腸黏膜通透性是評價腸黏膜屏障功能的重要指標。劉中輝等［6］研究發現，SAP早期的腸黏膜破壞導致腸道通透性明顯增加。本實驗結果發現，與對照組比較，EN及EIN組小腸黏膜厚度、絨毛高度及腸上皮損傷指數均有差異，亦證明SAP大鼠小腸存在腸道黏膜的損傷，然EIN組大鼠小腸的空腸光鏡變化、病理學評分及電鏡超微結構改變均較EN組輕微，提示應用腸內免疫微生態營養能較有效保護腸道，維護腸道黏膜屏障的完整性。

EIN是在普通EN的基礎上添加將谷氨酰胺、精氨酸、益生菌等有免疫促進及調節腸道菌群失調的特殊營養素。動物及臨床實驗表明，EIN可通過不同機制協助保護腸黏膜屏障［7］，抑制腸道菌群失調，減輕全身炎性反應，提高機體免疫，降低SAP的感染率［8－10］。D－乳酸是細菌發酵的代謝產物，當腸道通透性增加時腸道中細菌產生大量D－乳酸通過受損黏膜入血使血漿D－乳酸水平升高，故檢測血漿D－乳酸水平可及時反映腸壁通透性變化［11］。DAO是腸黏膜上層絨毛細胞胞質中具有高度活性的細胞內酶，在腸黏膜細胞受損、壞死后該酶釋放入血或隨壞死脫落的腸黏膜細胞進入腸腔內，可通過測定其在外周血中變化，作為反映腸黏膜完整性相對穩定的生化指標［12］。

本實驗發現，EN組及EIN組血清內毒素、D－乳酸及DAO水平均增高，說明SAP時存在內毒素血癥、腸道通透性增高。而EIN組血清內毒素、D－乳酸及DAO水平明顯低于EN組（P＜0.01或P＜0.05），提示應用EIN能有效保護腸道，減少腸道的通透性，維護腸黏膜屏障的完整性，降低SAP大鼠內毒素血癥。

綜上所述，本實驗通過多角度、多指標的研究，論證了EIN對SAP大鼠具有降低空腸的通透性，減少菌群移位，有助于對腸屏障功能的保護作用。當然其具體作用方式及機制還需進一步深入地研究。

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