黃連解毒湯對(duì)丙戊酸鈉在氯化鋰－匹羅卡品致癲癇大鼠體內(nèi)的減毒增效作用＊

周海云，李品軍，王 強(qiáng)，黃明春，劉 耀

（1.重慶市石柱縣人民醫(yī)院內(nèi)三科 409100；2.第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶400038）

丙戊酸鈉（sodium valproate，SVA）為臨床一線廣譜抗癲癇藥物，其作用機(jī)制與抑制γ－氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性，增強(qiáng)谷氨酸脫羧酶活性，升高腦內(nèi)γ－氨基丁酸有關(guān)［1－2］。但長(zhǎng)期服用SVA可導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)、學(xué)習(xí)記憶能力下降、肝功能受損等［3］。黃連解毒湯（HLT）可瀉火解毒，臨床上常用于各種熱癥、阿爾茨海默病等［4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)HLT同SVA等抗癲癇藥物合用，對(duì)緩解癲癇發(fā)作時(shí)的陣攣及焦躁精神狀態(tài)有一定效果。本研究對(duì)SVA聯(lián)合HLT對(duì)SVA的解毒增效作用及其機(jī)制進(jìn)行初步研究，為SVA的臨床使用提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取SPF級(jí)Wistar大鼠，全為雄性，5周齡，體質(zhì)量（210.2±9.2）g，由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（渝）2009－0001。

1.2 儀器與試劑 CM3050S型冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；Viva－E血藥濃度分析儀（德國(guó)Siemens公司）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSH－Px）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇南京建成生物工程公司，批號(hào)分別為20120616，20111218，20120908和20121015；Emit 2000SVA定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Siemens公司，批號(hào)20120612；匹羅卡品注射液（2mg／mL），購(gòu)自天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)20120310；氯化鋰（含量大于98%）購(gòu)自大連美羅生物科技有限公司，批號(hào)20120608；氫溴酸東莨菪堿注射液（0.3mg／mL）購(gòu)自成都第一制藥有限公司，批號(hào)20100816；SVA購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)20120915。HLT制備：取黃連、梔子、黃柏和黃芩4種中藥飲片均購(gòu)自太極集團(tuán)重慶中藥飲片有限公司，按1.5∶1.5∶1.0∶1.0加水煎煮3次，每次30min，過(guò)濾，合并濾液，60℃減壓濃縮至1.5g／mL（按生藥計(jì)）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組、造模與給藥 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模參照文獻(xiàn)［5－6］。造模成功后將癲癇模型大鼠分為5組（n＝10）：模型組、SVA組、SVA聯(lián)合HLT低劑量治療組、SVA聯(lián)合HLT中劑量治療組和SVA聯(lián)合HLT高劑量治療組。另選取10只健康大鼠為正常對(duì)照組。4個(gè)治療組藥物均用1mL 0.9%氯化鈉溶液溶解稀釋后灌胃給藥。其中，SVA組按100 mg·g－1·d－1給予SVA，低、中、高3個(gè)SVA聯(lián)合 HLT給藥大鼠則分別同時(shí)灌胃給予100mg·g－1·d－1劑量SVA及25、50和100mg·g－1·d－1HLT。對(duì)照組和模型組灌胃給予1 mL 0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥4周。末次給藥后觀察15 min內(nèi)大鼠出現(xiàn)癲癇反應(yīng)次數(shù)。

1.3.2 血液及肝臟標(biāo)本采集、勻漿 大鼠在觀測(cè)行為學(xué)指標(biāo)后繼續(xù)給藥48h后，腹腔注射10%水合氯醛（3.5mL／kg）麻醉，下腔靜脈取血后，處死，摘取肝臟標(biāo)本，取右葉以0.9%冰冷氯化鈉溶液沖洗后，部分干冰速凍保存。其余部分洗凈后勻漿，勻漿液用2倍量0.9%冰冷氯化鈉溶液和丙酮反復(fù)洗滌至上清無(wú)血色后，用3 000r／min離心15min沉淀，備用。

1.3.3 血清ALT、AST活性和SVA血藥濃度測(cè)定 ALT、AST活性測(cè)定參照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行，均采用賴氏比色法。SVA血藥濃度測(cè)定按定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 GSH－Px活性和 MDA水平檢測(cè) GSH－Px活性和MDA水平均參照試劑盒使用測(cè)定。GSH－Px活性測(cè)定采用而巰基比色法，MDA測(cè)定用硫代巴比妥酸比色法。

1.3.5 肝組織病理學(xué)檢查 剪取大鼠肝右葉相同部位，冷凍切片機(jī)切片，10%中性甲醛液固定，石蠟包埋、切片（厚4μm），蘇木素－伊紅（HE）染色。在每張切片上選取10個(gè)視野進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析方法，組間比較采用Tuckey法。單向有序計(jì)數(shù)資料采用 Wilcoxoh秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 合用SVA和HLT對(duì)癲癇大鼠行為學(xué)的影響 對(duì)照組大鼠沒(méi)有出現(xiàn)癲癇行為，模型組大鼠全部出現(xiàn)癲癇行為癥狀，按Racine分級(jí)判定，均為Ⅱ級(jí)以上表現(xiàn)，且各組半數(shù)（n＝5）表現(xiàn)Ⅲ級(jí)發(fā)作癥狀。SVA治療后，大部分實(shí)驗(yàn)大鼠仍有癇樣行為，但Racine分級(jí)表現(xiàn)有所降低，Ⅲ級(jí)以上表現(xiàn)僅4只大鼠，沒(méi)有大鼠發(fā)生Ⅴ級(jí)表現(xiàn)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同時(shí)服用SVA和不同劑量HLT處理的大鼠，其癲癇表現(xiàn)行為較模型組和SVA組進(jìn)一步改善，SVA聯(lián)合HLT高、中劑量治療，均未觀察到大鼠Ⅲ級(jí)及Ⅲ級(jí)以上癲癇發(fā)作癥狀，但與模型組及SVA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 合用SVA和HLT對(duì)癲癇大鼠行為學(xué)的影響（n）

2.2 SVA聯(lián)合HLT對(duì)癲癇大鼠ALT、AST、GSH－Px活性和MDA水平的影響 對(duì)照組大鼠與模型組大鼠的血清ALT、AST、GSH－Px活性和 MDA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在給予SVA 100mg·g－1·d－14周后，大鼠血清中ALT、AST活性和肝組織MDA水平顯著增加（P＜0.01），而肝GSH－Px活性明顯下降（P＜0.05）。同時(shí)給予SVA和HLT，ALT、AST較單獨(dú)給予SVA下降，且下降程度SVA聯(lián)合高劑量HLT組＞SVA聯(lián)合中劑量HLT組＞SVA聯(lián)合低劑量HLT組。而SVA聯(lián)合高劑量HLT組（100mg·g－1·d－1）給藥較SVA組，對(duì) GSH－Px活性下降顯著減少（P＜0.05）。但SVA和不同劑量HLT聯(lián)合使用，對(duì)肝組織 MDA水平?jīng)]有明顯影響。

表2 合用SVA和HLT對(duì)癲癇大鼠ALT、AST、GSH－Px和MDA的影響±s，n＝10）

表2 合用SVA和HLT對(duì)癲癇大鼠ALT、AST、GSH－Px和MDA的影響±s，n＝10）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.05、d：P＜0.01，與SVA組比較。

組別 ALT（U·mL－1） AST（U·mL－1） GSH－Px（U·mg－1·prot－1） MDA（mol·g－1·prot－1）對(duì)照組 17.15±3.18 25.33±2.09 64.05±14.06 6.75±3.77模型組 17.74±2.25 24.54±8.53 61.59±4.80 6.52±0.95 SVA組 45.08±9.11b 85.00±7.50b 46.31±6.43a 10.75±2.18a SVA聯(lián)合低劑量HLT組 39.86±4.19b 91.35±12.55b 48.29±7.39a 11.57±0.68a SVA聯(lián)合中劑量HLT組 36.22±1.84bc 67.36±10.09bc 54.20±8.28 10.98±4.35a SVA聯(lián)合高劑量HLT組 25.72±0.86bd 47.79±7.19ad 52.15±10.20c 10.06±1.33a

圖1 SVA聯(lián)合HLT對(duì)癲癇大鼠SVA血藥濃度的影響（n＝10）

2.3 SVA聯(lián)合HLT對(duì)SVA血藥濃度的影響 SVA血藥濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。多次給藥后SVA組大鼠血藥濃度在178.560～209.367μg·mL－1。合用 HLT后，癲癇大鼠體內(nèi)SVA血藥濃度下降，其中SVA聯(lián)合中劑量和SVA聯(lián)合高劑量組SVA血藥濃度下降明顯（P＜0.01），兩組血藥濃度最低分別僅132.54μg·mL－1和85.396μg·mL－1。

2.4 肝組織病理學(xué)觀察 對(duì)照組和模型組肝病理組織學(xué)檢查未見(jiàn)異常。SVA組50%以上肝細(xì)胞水腫，核固縮，可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死和小灶性壞死，并伴有炎癥浸潤(rùn)，可見(jiàn)肝中央靜脈擴(kuò)張（圖2C）。SVA聯(lián)合HLT治療后，肝細(xì)胞狀況明顯改善散布。SVA聯(lián)合中劑量HLT組肝細(xì)胞腫脹變性明顯少于SVA組，但匯管區(qū)仍可觀察到少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)嗜酸小體形成，未發(fā)現(xiàn)小灶性壞死點(diǎn)。而SVA聯(lián)合高劑量HLT組（圖2F）肝細(xì)胞排列整齊，形態(tài)大小較一致，未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死，但仍可見(jiàn)極 少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 SVA聯(lián)合HLT對(duì)癲癇大鼠肝臟組織病理改變的影響（HE×400）

3 討 論

HLT能改善阿爾茨海默病引起的學(xué)習(xí)記憶能力下降［7］、癲癇性精神病的情緒癥狀等［8］。目前對(duì)用于癲癇的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用匹羅卡品－氯化鋰致癲癇大鼠模型，對(duì)SVA單用及合用不同劑量HLT后SVA藥效及肝毒性進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時(shí)服用SVA和HLT使癲癇模型大鼠的SVA血藥濃度明顯下降，說(shuō)明HLT能影響SVA的體內(nèi)代謝過(guò)程，但其機(jī)制不清楚。目前研究認(rèn)為SVA在體內(nèi)主要經(jīng)肝細(xì)胞色素P450酶系代謝，主要是 CYP2s［9］。王晉朝等［9］和李丹等［10］研究發(fā)現(xiàn)HLT及其組分黃芩苷、小檗堿等能影響CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9的表達(dá)和活性［4］。因此合用 HLT致SVA血藥濃度下降可能與其影響CYP酶有關(guān)。

合用HLT導(dǎo)致SVA血藥濃度下降，但其抗癇作用并未減弱。有研究發(fā)現(xiàn)HLT可促進(jìn)尼莫地平在大鼠腦組織中分布增加［11］，該作用與其促進(jìn)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)尼莫地平的攝取、改善尼莫地平在血腦屏障上的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)［12］。因此，HLT這種降低SVA血藥濃度同時(shí)未降低其治療效果的機(jī)制可能與HLT改善SVA在血腦屏障上的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。此外，另有研究發(fā)現(xiàn)HLT可改善癡呆小鼠和大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，改善腦部缺血狀況［7－8］，影響炎癥通路如NF－κB通路等［13－14］，因此，HLT同SVA的協(xié)同作用也可能與HLT自身的藥理機(jī)制有關(guān)。

合用HLT能不同程度逆轉(zhuǎn)SVA治療癲癇大鼠導(dǎo)致的ALT、AST上升和GSH－Px活性下降，表明合用HLT對(duì)SVA導(dǎo)致的肝損傷具有拮抗作用。ALT，AST均屬非特異性細(xì)胞內(nèi)功能酶，正常時(shí)血清內(nèi)含量很低；當(dāng)肝細(xì)胞受損，肝細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，其活性迅速增強(qiáng)。GSH－Px活性下降，也與組織細(xì)胞氧化損傷有關(guān)。因此，HLT對(duì)SVA致肝損傷的拮抗作用可能與其細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)。

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