大鼠腦出血后蛋白酶激活受體－1與細胞凋亡關系的實驗研究＊

張德綢，白 雪，楊云芳，羅 鋼

（瀘州醫學院附屬中醫院心腦病科，四川瀘州646000）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是最常見的急性腦血管性疾病，發病率0.86%～7.32%，病死率50.0%～67.7%，存活患者約3／4不同程度地喪失勞動能力，嚴重者喪失自理能力，給家庭及社會帶來沉重的經濟負擔等［1－2］。近年研究表明，ICH后血腫周圍組織存在大量蛋白酶激活受體－1（proteinase activated receptor－1，PAR－1）可引起細胞凋亡，但ICH后PAR－1、小膠質細胞與神經凋亡細胞關系未見研究報道。本實驗主要采用ICH大鼠模型，探討ICH后PAR－1、血腫周圍神經細胞凋亡、小膠質細胞之間關系及PAR－1在ICH后腦損傷可能存在的病理、生理機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只280～320g（由瀘州醫學院實驗動物中心提供），PAR－1抗體（Sigma公司），TUNEI試劑盒（Roche公司），OX－42（CD11b）單抗（Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及動物模型建立 實驗動物分為假手術組、ICH組，每組30只，每組再隨機分為6個亞組。本實驗采用自體不凝血注入大鼠ICH模型，參照Xue等［3］方法制備腦出血模型。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（30mg／kg）后固定于大鼠腦立體定位儀上，正中切開頭皮，暴露前囟、冠狀縫，選擇前囟后0.5mm、右3.0mm、深度5.5mm為自體凝血注射部位；同時剪斷鼠尾，含抗凝劑EP管收集鼠尾滴下血，微量注射器抽不凝血50μL緩慢勻速5μL／min注入殼尾核，骨蠟填塞針孔，縫合頭皮。假手術組以0.9%生理鹽水50μL代替自體血。術后給予同等環境及飼料喂養。術后不同時間點：6h、1 d、2d、3d、5d、7d斷頭處死大鼠。

1.2.2 觀察指標

1.2.2.1 PAR－1陽性細胞數 將各組各時間點大鼠斷頭取腦，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，取出腦組織在血腫區做冠狀切片，常規脫水、浸蠟、包埋，將腦組織切成厚4mm切片，采用免疫組織化學染色（SP）法觀察PAR－1陽性細胞數，將SP法染色切片在400倍光學顯微鏡下觀察，主要分布在血腫周圍組織，胞膜、胞質呈棕黃色，可清楚的分辨出細胞核形態的為PAR－1陽性細胞。隨機選取5個視野，取其平均值。

1.2.2.2 凋亡神經細胞計數 腦組織石蠟載片用TUNEL原位染色（按說明書進行），400倍光學顯微鏡下觀察，細胞核中有紫紅色顆粒者為TUNEL染色陽性凋亡神經細胞。凋亡細胞計數方法同PAR－1SP法。

1.2.2.3 小膠質細胞計數 使用OX－42標記小膠質細胞方法［4］。OX－42陽性細胞：主要是小膠質細胞（核呈棕黃色）。ICH組在6h時OX－42染色較淺，數量少，細胞形態欠清楚，尚可見長的突起，24h時數量明顯增多，形態改變呈圓形、橢圓型或梭型，2d時數量和體積達高峰，以后逐漸減少，7d仍可觀察到其數量較少、形態變化不大。在假手術組未見有OX－42陽性細胞。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料以s表示。ICH組內各時間點及與假手術組比較采用單因素方差分析，確定有差異后采用最小有意義差異法比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

ICH組不同時點血腫周圍PAR－1陽性細胞、凋亡細胞、小膠質細胞與假手術組比較明顯增加，PAR－1陽性細胞、凋亡細胞3d達高峰，之后PAR－1逐漸下降至正常，但凋亡細胞下降緩慢仍維持較高水平，小膠質細胞2d達高峰，之后逐漸下降，與PAR－1陽性細胞、凋亡細胞比較三者呈正相關（P＜0.05），見表1～3。光鏡下血腫周圍組織，胞漿或胞核中染有棕黃色顆粒者為PAR－1陽性細胞；染色質濃集于核周、呈新月形、環形、長條形、塊狀小體甚至形成核碎片狀為凋亡細胞；小膠質細胞為OX－42標記的陽性細胞，核呈棕黃色，有突起，見圖1～6。

表1 兩組PAR－1陽性細胞數±s）

表1 兩組PAR－1陽性細胞數±s）

＊：P＜0.05，與假手術組比較；△：P＜0.05，與ICH組3d比較。

組別6 31.30±4.53 31.30±4.53 ICH組 69.40±6.87＊△ 168.00±6.27＊△ 245.00±4.72＊△ 298.00±8.05＊ 97.70±5.57＊△ 30.60±5.57 6h 1d 2d 3d 5d 7d假手術組 16.00±5.13 16.00±3.28 31.50±5.93 31.80±3.7△

表2 兩組TUNEL染色陽性細胞數±s）

表2 兩組TUNEL染色陽性細胞數±s）

＊：P＜0.05，與假手術組比較；△：P＜0.05，與ICH組3d比較。

組別0±1.65 3.40±1.61 ICH組 65.00±2.69＊△ 91.80±8.29＊△ 106.00±5.31＊ 171.00±6.76＊ 112.30±7.67＊△ 98.20±8.33 6h 1d 2d 3d 5d 7d假手術組 3.60±1.24 3.40±2.01 3.50±2.59 3.50±1.96 3.3＊△

表3 兩組小膠質細胞數比較

表3 兩組小膠質細胞數比較

＊：P＜0.05，與假手術組比較；△：P＜0.05，與ICH組2d比較。

組別6h 1d 2d 3d 5d 7d假手術組000000 ICH組 28.30±3.68＊△ 62.80±5.78＊△ 96.80±9.57＊ 79.60±7.89＊△ 50.30±8.12＊△ 16.90±6.32＊△

圖1 假手術組PAR－1陽性細胞（×400）；

圖2 ICH組3dPAR－1陽性細胞（×400）；

圖3 假手術組TUNEL陽性細胞（×400）

圖4 ICH組3dTUNEL陽性細胞（×400）；

圖5 假手術組OX－42陽性細胞（×400）；

圖6 ICH組2dOX－42陽性細胞（×400）

3 討 論

ICH最主要的病理改變為血腫對周圍腦組織的壓迫和血腫的介質釋放所誘發的繼發性損傷。血腫壓迫周圍腦組織可引起血腫周圍腦組織機械性損傷，同時占位效應導致血腫周圍微循環障礙、血管痙攣、再灌注損傷等，進一步引起腦組織缺血、缺氧，發生腦神經細胞的缺血壞死［5］。另外，血腫壓迫周圍腦組織血液循環障礙，繼發性酸中毒、血管麻痹、血液分解產物釋放生物活性物質等加重對腦組織的損害；血管內皮細胞損傷產生的內皮素可導致細胞內鈣離子超載激惹神經毒性氨基酸，促進神經細胞的缺血壞死和凋亡。

ICH后血腫降解釋放出凝血酶、血紅蛋白、血漿蛋白和C反應蛋白等活性物質，在對ICH后腦組織繼發性損傷中凝血酶占據重要角色［6－7］。凝血酶由無活性的凝血酶原產生，是凝血級聯反應過程的關鍵酶，也是重要的細胞外信號因子之一［8－9］。凝血酶的生物活性主要由 PAR－1介導，PAR－1在腦內海馬、丘腦、下丘腦、紋狀體等部位廣泛分布。正常生理狀態下，體內有PAR－1少量表達，激活后介導跨膜信號轉導：細胞內Ca2＋的移動和蛋白磷酸化，產生一系列生理效應［10］；病理狀態下，組織損傷后，PAR－1表達明顯上調，可能介導凝血酶的系列反應，引起神經細胞毒性損傷，導致死亡［11－13］。

本實驗結果顯示，ICH后血腫周圍PAR－1陽性細胞、凋亡細胞、小膠質細胞明顯增加，PAR－1陽性細胞、凋亡細胞3d達到高峰，小膠質細胞2d達到高峰，高峰之后逐漸下降，說明ICH后PAR－1陽性細胞與神經凋亡細胞、小膠質細胞的表達基本一致，ICH后PAR－1表達上調可能通過以下途徑引起細胞凋亡：（1）血腫壓迫周圍腦組織導致機械性損傷致腦神經細胞的凋亡。局部腦組織受擠壓發生缺血改變，腦血管通透性的增加致腦水腫及腦內高壓加重腦組織缺血、缺氧，進而可能介導PAR－1釋放增加，凝血酶原大量激活導致一系列級聯反應，神經細胞凋亡明顯增加，和李恒等［14］實驗研究PAR－1與凝血酶在ICH后的表達趨勢基本一致；（2）血腫本身的血細胞破壞、炎性介質釋放，大量凝血酶原激活可能通過PAR－l介導而增加血腦屏障通透性，造成血管源性腦水腫，另外，凝血酶也可能通過PAR－1介導而影響水通道蛋白4的機能［15］，加劇ICH后腦組織水腫。（3）除作為ICH啟動腦水腫形成的“扳機點”外，凝血酶可以通過PAR－1介導引起小膠質細胞的激活，然后可能通過2條途徑發揮細胞毒性效應。一是通過釋放一系列潛在的神經毒性物質、炎性因子和酶等導致繼發性腦損害，介導神經細胞凋亡；二是通過與神經細胞直接接觸，發揮腦內吞噬細胞的毒性作用［16－17］，進而可能加重ICH后的繼發性損傷。

本研究表明，ICH后凝血酶可能通過不斷激活PAR－1，PAR－1再次激活神經小膠質細胞大量產生盡而進一步損害腦神經細胞和對細胞毒性損害作用，造成腦細胞毒性水腫、炎性介質反應等多種損傷機制導致神經細胞凋亡。ICH腦出血損傷的病理生理機制極其復雜，通過對PAR－1介導的腦神經細胞的凋亡的深入研究可能對今后臨床治療ICH提供一定的科學依據。

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