茵陳蒿水提液對腦出血大鼠TNF-a、IL-1β表達的研究

李培育，和 梅，左寒璐

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154003)

茵陳蒿［1，2］為多年生草本艾科植物，目前對其治療腦出血具體機制方面的研究報道很少。腫瘤壞死因子 α［3～5］(Tumor necrosis factor TNF-a)各種病因所致腦水腫均可觀察到TNF-a的過度表達。腦出血時局部腦組織釋放促凝血酶原激酶，激活補體的級聯反應，生成C5a，在C5a存在的情況下，巨噬細胞被激活產生TNF-a。細胞因子中白細胞介素-1β(Interleukin-1βIL-1β)是一種重要的炎性細胞因子，IL-1β［6，7］可能參與了缺血性腦損傷引起的神經元的死亡，在缺血性病理損傷中起重要的作用。其可以通過刺激內皮細胞表達白細胞黏附分子，使白細胞聚集在缺血腦組織，加重腦組織損害。本文旨在研究茵陳蒿水提液對腦出血模型大鼠腦出血周圍組織IL-1β、TNF-a的表達的影響，為茵陳蒿提取液在臨床的應用提供理論基礎和技術支持，讓其更廣泛地應用于腦出血患者。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

純系Wistar大鼠100只，雌性50只，雄性50只，2～3月齡，體重200～250g，由佳木斯大學動物實驗中心提供。

1.2 實驗中藥

茵陳蒿由藥店采購，經鑒定符合藥典標準。RT-PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)；TNF-a免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；IL-1β免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 實驗方法

將100只Wistar大鼠隨機分成4組，即正常對照組、創傷模型組、低劑量組(50mg/kg·d)、高劑量組(150mg/kg·d)，參照 Rosenberg等［8］報道的方法采用注射膠原酶Ⅶ造模。模型成功判斷按Bederson［42］的評定方法分成三級，具體為：I級：將大鼠尾巴提起癱瘓側前肢回收屈曲于腹下，正常側前肢向地面伸展；Ⅱ級：除I級體征外向癱瘓側推大鼠時阻力較對側明顯降低；Ⅲ級：除以上體征外大鼠有向癱瘓側旋轉的行為。茵陳蒿水提液高、低劑量組于造模后立即灌胃給藥。高劑量組0.1mL/g·d，低劑量組0.05mL/g·d，均每日分兩次灌服，用藥到相應時間點。ICH對照組：造模后立即灌服等體積生理鹽水，與用藥組時間相同。于造模成功后1d、3d、7d分時間點處死，取動物出血部位腦組織進行實驗檢測。

1.4 檢測方法

免疫組織化學法檢測肝組織TNF-a、IL-1β，按試劑盒說明書操作。用β-actin作為內參。按照按PCR試劑盒說明操作。

1.5 統計學處理

采用SPSS 17.0統計分析軟件對實驗數據進行統計學處理，進行方差分析、組間差異性檢驗用q檢驗。以均數±標準差()表示。

2 結果

2.1 IL-1β免疫組化結果

見表1。

表1 各組間不同時間點IL-1β顯色指數()

表1 各組間不同時間點IL-1β顯色指數()

注：各組與正常組比*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。與模型組相比#P＜0.05，與模型組相比## P＜0.01，與低劑量組相比＆P＜0.05

組別1d 3d 7d正常組6.63±0.31 8.26±0.22 4.32±0.12模型組 92.33±3.52＊＊ 84.26±2.71＊＊ 70.43±3.35*低劑量組 84.54±4.13＊＊ 74.63±3.15* 60.54±2.53*#高劑量組 77.37±3.72* 54.65±3.28*# 35.55±2.02＊＊##＆

治療1d后正常對照組比較模型組IL-1β免疫組織化學顯色指數明顯升高(P＜0.01)；高劑量組低劑量組顯色指數與模型組相比無統計學意義(P＞0.05)。治療3d后正常對照組比較模型組IL-1β免疫組織化學顯色指數明顯升高(P＜0.01)，治療高、低劑量組IL-1β顯色指數明顯低于模型組(P＜0.05)，高、低劑量組之間無顯色指數無差異(P＞0.05)；治療7d后正常對照組比較模型組IL-1β免疫組織化學顯色指數明顯升高(P＜0.01)，治療高、低劑量組IL-1β顯色指數明顯低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，高劑量組IL-1β顯色指數明顯低于低劑量組(P＜0.05)。

2.2 TNF-a免疫組化結果

見表2。

表2 各組間TNF-a顯色指數比較(x± s，%)

治療1d后正常對照組比較模型組TNF-a免疫組織化學顯色指數明顯升高(P＜0.01)；高劑量組、低劑量組顯色指數與模型組相比無統計學意義(P＞0.05)。治療3d后正常對照組比較模型組TNF-a免疫組織化學顯色指數明顯升高(P＜0.01)，治療高、低劑量組TNF-a顯色指數明顯低于模型組(P＜0.05)，高、低劑量組之間無顯色指數無差異(P＞0.05)。

2.3 RT-PCR結果

2.3.1 茵陳蒿水提液對大鼠血腫周圍腦組織IL-1βmRNA表達的結果，見表3。

表3 茵陳蒿水提液對大鼠血腫周圍腦組織IL-1βmRNA表達的影響(n=8)

治療1d后腦出血模型組大鼠腦血腫周圍組織IL-1β mRNA表達水平比正常對照組明顯增多，茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達水平較模型組無明顯差異，結果無著性意義。治療3d后腦出血模型組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達水平比正常對照組明顯增多，茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達水平較模型組下調，差異有極顯著性意義(P＜0.05)。提示茵陳蒿水提液高、低劑量在治療3d后可降低大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達。治療7d后茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達水平較模型組下調，差異有極顯著性意義(P＜0.05或P＜0.01)。提示茵陳蒿水提液高、低劑量在治療7d后可降低大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達。

2.3.2 茵陳蒿水提液對大鼠血腫周圍腦組織TNF-αmRNA表達的結果，見表4。

表4 茵陳蒿水提液對大鼠血腫周圍腦組織TNF-αmRNA表達的影響(n=8)

治療1d后腦出血模型組大鼠腦血腫周圍組織TNF-α mRNA表達水平比正常對照組明顯增多，茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織TNF-αmRNA表達水平較模型組無明顯差異，結果無著性意義。治療3d后茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織TNF-α mRNA表達水平較模型組下調，結果有著性意義(P＜0.05)。高劑量組與低劑量組TNF-αmRNA表達無顯著意義。治療7d后茵陳蒿水提液高劑量組、低劑量組大鼠腦血腫周圍組織TNF-αmRNA表達水平較模型組下調，差異有極顯著性意義(P＜0.05或P＜0.01)。提示茵陳蒿水提液高、低劑量在治療7d后可降低大鼠腦血腫周圍組織IL-1βmRNA表達。茵陳蒿水提液高劑量組IL-1βmRNA表達較低劑量下調，差異有顯著意義(P＜0.05)。

3 討論

在腦出血中，炎癥反應是其中的重要環節，在引起腦血腫占位效應的同時還可以繼發破壞周圍組織。引起一系列反應進而加重組織損害。IL-1β炎癥反應中的關鍵因子，它是由腦實質內的炎癥細胞激活腦神經小膠質細胞分泌的一種細胞因子，它可以激活過釋放脂源性介質促進脂質過氧化反應，進而產生氧自由基，用來破壞神經元的細胞膜加重腦組織壞死，同時IL-1β能釋放大量毒性產物和破壞性蛋白酶，致使神經細胞遭到損害［9，10］。

TNF-α是一種炎癥前體細胞因子，在炎癥反應中起著重要作用［11］。它可以促進IL-1分泌，還能促進白細胞分泌，同時參與炎癥損傷的過程，TNF-α、IL-1β也可誘導趨化因子(chemokines)表達“趨化因子可直接或間接誘導另一些細胞的活動，為炎癥細胞直接進入損傷組織提供化學梯度”，加重炎癥反應，破壞腦組織。

在本實驗中，造模后1d模型組大鼠腦血腫周圍組織的TNF-α、IL-1β免疫組化顯色指數均較正常對照組明顯上調(P＜0.05或P＜0.01)；模型組大鼠腦血腫周圍組織TNF-α、IL-1β的 mRNA表達也均較正常組上調(P＜0.05或P＜0.01)。

從以上結果表明，茵陳蒿水提液可以對腦出血的大鼠有一定的治療作用，其可能的的機制為抑制IL-1β、TNF-α的表達，從而減輕炎癥反應，減小對腦組織的傷害來實現，在治療的3d后高劑量組和低劑量組IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表達無明顯差異性(P＞0.05)。隨著治療時間的延長發現，治療7d后高劑量組IL-1β、TNF-αmRNA及蛋白表達較模型、正常組、低劑量組明顯增高。因此可以說明隨著治療時間的延長，茵陳蒿水提液高劑量的治療效果較低劑量效果要好。

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