厄貝沙坦對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化干預作用

劉中柱，潘明陽，劉艷姝，史為伍，牛效清

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154003)

腎間質纖維化的過程包括腎小管的損傷、細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)的過多沉積、多個細胞因子參與的復雜過程。TGF-β1致纖維化作用較強，故TGF-β1是預防、治療腎間質纖維化目標性因子。最近，結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和骨形成蛋白-7(bonemorphogenetic protein-7，BMP-7)作為 TGF-β1致纖維化的重要調節因子而出現。厄貝沙坦目前已廣泛用于臨床，并起到保護腎功和降低尿蛋白的功效。本實驗通過結扎大鼠單側輸尿管建立UUO模型，觀察大鼠腎臟的病理變化，免疫組化法檢測CTGF和BMP-7的表達，探討厄貝沙坦的藥物作用。

1 材料方法

1.1 主要材料

厄貝沙坦片(賽諾菲(杭州)制藥有限公司)；兔抗大鼠CTGF多克隆抗體(武漢博士德公司)；兔抗大鼠BMP-7多克隆抗體(武漢博士德公司)；SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)；多聚賴氨酸(武漢博士德公司)；CX41RF型高級顯微鏡(日本Olympus公司)；切片機(英國姍頓公司)；病理圖文彩色分析系統(同濟千屏影像公司)。

1.2 實驗動物分組

雄性Wistar大鼠36只，體重(200±20)g。建立模型：腹部常規碘伏消毒，10%水合氯醛0.4mL/100g經腹腔注射麻醉，麻醉后左側背部剪毛，碘伏消毒，于左側背部肋弓處下方0.5cm處切開腹腔，暴露并分離左側輸尿管，結扎腎盂出口處及輸尿管上段輸尿管，并在結扎中點處離斷輸尿管，逐層縫合筋膜、肌肉、皮膚。假手術組僅分離不結扎左側輸尿管。治療組給予厄貝沙坦20mg/kg·d，每日一次。假手術組、模型組每天給予相同劑量的生理鹽水。

1.3 標本收集

分別于造模成功后14d和28d，各組分別處死6只大鼠，迅速取出左腎，去包膜固定于10%的中性甲醛中，石蠟包埋并編號，切片機將蠟塊切成3μm切片，分別留取HE、MASSON染色和免疫組化標本。

1.4 統計學分析

采用SPSS13.0軟件包進行統計學處理。結果以均數±標準差()表示。任意兩組比較方差齊時采用SNK(Student-Newman-Keuls)檢驗，方差不齊時采用Wilcoxon秩和檢驗(Wilcoxon rank sum test)。

2 結果

2.1 免疫組化結果

假手術組僅有少量CTGF表達，但BMP-7相對表達較多，且在處表達較高。模型組中CTGF表達較多，且在處表達較高，BMP-7相對表達較少。厄貝沙坦治療組與模型組比較，CTGF表達較低，而BMP-7表達較高。

表1 CTGF在大鼠腎間質陽性面積表達百分比結果(%，x± s，n=6)

表2 BMP-7在大鼠腎間質陽性面積表達百分比結果(%，x± s，n=6)

2.2 HE、MASSON染色結果

表3 HE染色陽性面積百分比結果(%，x± s，n=6)

表4 MASSON染色陽性面積百分比結果(%，x± s，n=6)

3 討論

目前，細胞因子參與腎間質纖維化已受到國內外學者的關注。其中，CTGF是促腎間質纖維化的重要因子。有研究證實CTGF不但能誘導TGF-β1生成，而且可增強TGF-β1的生物學活動［1，2］。CTGF 能增加細胞外基質的合成［1］。因此降低CTGF的表達，可減緩腎間質纖維化的進程。BMP-7高度表達于腎臟，參與組織修復和生長，并會對抗腎間質纖維化。在單側輸尿管梗阻(UUO)、腎盂腎炎、慢性移植物腎臟病等動物實驗中，BMP-7mRNA及其蛋白表達均下調［3～5］。在培養的系膜細胞和足細胞中，BMP-7能抑制由TGF-β1、醛固酮、高糖等引起的負作用［6～8］。在 BMP-7 對腎小管上皮細胞作用的研究中，BMP-7被證實能抑制TGF-β1的生成，降低促炎癥因子基因和趨化因子的表達，并能抑制由多發性骨髓瘤誘導的EMT［9～11］。因此，增加BMP-7的表達能起到保護腎臟的作用。

作為腎素-血管緊張素系統(renin-angiotension system，RAS)的主要效應器，血管緊張素 II(angiotensionII，Ang II)主要在出球小動脈發揮收縮功能，進而增加腎小球內液壓。而腎小球內壓力的增加可造成和加重腎損害［12］。厄貝沙坦能阻斷AT1受體和Ang II結合，降低腎小球內液壓，從而發揮保護作用。Zhao等［13］在5/6大鼠腎臟切除模型中，發現厄貝沙坦治療組TGF-β1、smad2、AT1R表達下調，而smad6表達上調，進而發揮治療腎功不全的作用。Dai等［14］在對糖尿病腎病大鼠實驗中，認為厄貝沙坦能抑制整合素連接激酶(Integrin-linked kinase，ILK)的過度表達，并能保護足細胞數量，從而預防疾病進展。

本實驗通過免疫組化觀察CTGF的表達結果，發現治療組的表達低于模型組，而檢測BMP-7的表達，發現治療組BMP-7的表達高于模型組。病理結果得出治療組腎間質纖維化程度低于模型組。以上結果說明厄貝沙坦可通過下調CTGF的表達和上調BMP-7的表達，從而起到保護腎臟的作用。由于腎間質纖維化是一個多因子參與的復雜過程，厄貝沙坦保護腎臟的藥物作用，目前尚需要進一步的臨床和基礎實驗研究。

［1］D Kothapalli，K S Frazier，R Segarini，et al.Transforming growth factor beta induces anchorage-independent growth of NRK fibroblasts via a connective tissue growth factor-dependent signaling pathway［J］.Cell GrowthDiffer，1997，8(1)：61 68

［2］M R Duncan，K S Frazier，S Abramson，et al.Connective tissue growth factormediates transforming growth factor beta-induced collagen synthesis：down-regulation by cAMP［J］.FASEB J，1999，13(13)：1774 14786

［3］Liapis K，Loveday S，Klahr TK，etal.Osteogenic protein-1 prevents renal fibrogenesis associated with ureteralobstruction［J］.Am JPhysiol Renal Physiol，2000，279(1)：130 143

［4］N K Biyikli，H Tugtepe，FCakalagaoglu，etal.Downregulation of the expression of bone morphogenetic protein 7 in experimental pyelonephritis［J］.Pediatr Nephrol，2005，20(9)：1230 1236

［5］B Ogutmen，S Tuglular，F Cakalagaoglu，et al.Transforming growth factor-beta1，vascular endothelial growth factor，and bonemorphogenic protein-7 expression in tacrolimus-induced nephrotoxicity in rats［J］.Transplant Proc，2006，38(2)：487 489

［6］GM Mitu，SWang，and R Hirschberg.BMP7 is a podocyte survival factor and rescues podocytes from diabetic injury［J］.Am JPhysiol Renal Physiol，2007，293(5)：1641 1648

［7］L De Petris，K A Hruska，S Chiechio，et al.Bone morphogenetic protein-7 delays podocyte injury due to high glucose［J］.Nephrol DialTransplant，2007，22(12)：3442 3450

［8］H Otani，F Otsuka，K Inagaki，et al.Antagonisticeffects of bone morphogenetic protein-4 and-7 on renalmesangial cell proliferation induced by aldosterone through MAPK activation［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2007，292(5)：1513 1525

［9］SE Gould，M Day，SS Jones，etal.BMP-7 regulates chemokine，cytokine，and hemodynamic gene expressionin proximal tubule cells［J］.Kidney Int Kidney Int，2002，61(1)：51 60

［10］X L Zhang，W Selbi，M C de la Motte，et al.Bone morphogenic protein-7 inhibitsmonocyte-stimulated TGF-beta1 generation in renal proximal tubular epithelial cells［J］.Jm Soc Nephrol，2005，16(1)：79 89

［11］M Hering-Smith，E，E Simon.Myeloma light chains induce epithelialmesenchymal transition in human renal proximal tubule epithelial cells［J］.Nephrol Dial Transplant，2008，23(3)：860 870

［12］Wolf G，Neilson E.Angiotensin II induces cellular hypertrophy in cultured murine proximal tubular cells［J］.Am JPhysiol，1990，259(5)：768 777

［13］Zhao G，Zhao H，Tu L，et al.Effects and mechanism of irbesartan on tubulointerstitial fibrosis in 5/6 nephrectomized rats［J］.JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2010，30(1)：48 54

［14］Dai HY，Zheng M，Tang RN，et al.Inhibition of integrin-linked kinase by angiotensin II receptor antagonist，irbesartan attenuates podocyte injury in diabetic rats［J］.Chin Med J(Engl)，2012，125(5)：88 93