胃癌ERCC1基因甲基化的研究

朱瑞杰 王紅兵

目前胃癌被認為是1種多基因遺傳和表觀遺傳的綜合性病變[1]。核苷酸切除修復交叉互補基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)是1種重要的DNA修復基因。本研究采用甲基化特異性PCR(MSP)技術檢測胃癌ERCC1基因甲基化狀態，以了解胃癌組織、相應癌旁組織及正常胃組織中ERCC1基因甲基化水平。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2012年5月-2012年8月徐州醫學院附屬醫院普外科手術切除的新鮮胃癌組織共30例。相應的30例癌旁組織作為對照組，另取10例胃部良性病變旁正常胃組織也作為對照組。癌旁組織距離癌組織5 cm以上。30例患者中男性18例，女性12例，年齡37～77歲，中位年齡53歲。所有病例術前均未接受過放化療，每例均有詳細的臨床資料和手術記錄，且均經術后病理檢查證實。所有標本均于術后半小時內獲得，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：基因組DNA提取試劑、EZ DNA甲基化試劑盒-Gold、PCR試劑。儀器：PCR儀、紫外分光光度儀。

1.3 方法

1.3.1 組織DNA提取和甲基化修飾 每個樣本取30 mg左右組織塊進行勻漿處理，參照組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，UV3000紫外分光光度儀測定DNA濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8～2.0之間的DNA用于甲基化修飾。各樣本DNA取800 ng，參照EZ DNA甲基化試劑盒說明書進行甲基化修飾，修飾好的DNA洗脫后于-20 ℃保存。

1.3.2 甲基化特異性 PCR (methylation specific PCR,MSP)取修飾好的DNA 2 μl進行MSP反應。ERCC1基因甲基化引物：M，F：5′-TTTAGGATTATAGAGAGTAGCGCGA-3′，R：5′-CAAAAAAAATAAAAACGATACAACG-3′。非甲基化引物：U，F：5′-TTTAGGATTATAGAGAGTAGTGTGA-3′，R：5′-AAAAAAATAAAAACAATACAACACC-3′。反應體系按照PCR試劑盒推薦量25 μl體系進行：PCR混合液12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，模板2 μl，無核酶水9.5 μl。MSP循環條件：97 ℃預變性5 min，然后進行40個循環擴增：95 ℃變性40 s，甲基化引物及非甲基化引物分別在57 ℃、55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，最后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。甲基化特異性引物(M)擴增的目的片段為166 bp，非甲基化特異性引物(U)擴增的目的片段為164 bp。取10 μl PCR產物在2.5%瓊脂糖凝膠上電泳，以TIANGEN 100 bp DNA Ladder (MD101-01)為標準DNA Marker同步電泳，溴化乙啶染色后凝膠成像系統觀察結果并記錄。判斷標準[2]：M陽性、U陰性為完全甲基化；M陽性、U陽性為部分甲基化；M陰性、U陽性為非甲基化。

1.4 統計學處理

統計分析應用SPSS16.0版統計軟件。甲基化結果采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

30例胃癌組織中ERCC1基因發生完全甲基化14例，發生部分甲基化9例，甲基化率為76.7% (23/30)；相應的癌旁組織中發生完全甲基化1例，發生部分甲基化3例，甲基化率為13.3% (4/30)，兩者差異有統計學意義(χ2=12.15，P<0.05)。10例正常胃組織均未出現甲基化條帶，見圖1。

A為胃癌組織的完全甲基化；B為胃癌組織的部分甲基化；C為癌旁組織的完全甲基化；D為癌旁組織的部分甲基化；E為正常胃組織的非甲基化；M為甲基化(166 bp)；U為非甲基化(164 bp)

圖1 ERCC1基因甲基化檢測(MSP)

3 討論

表觀遺傳學(Epigenetics)是由C.H.Waddington首先提出的。Holiday針對“Epigenetics”作出了更加系統性的論斷，即“DNA序列不發生改變的情況下，所發生的可遺傳性基因表達的改變”[3]，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、基因組印記、隔離蛋白以及非編碼RNA調控等。DNA甲基化是基因表達的重要表觀遺傳學形式，在細胞生長、胚胎發育、基因表達調控、寄生DNA序列的抑制、基因組結構的穩定等方面發揮著不可缺少的作用，是目前研究最多也最為深入的表觀遺傳學表達機制。

核苷酸切除修復交叉互補基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)是DNA損傷修復基因，是核苷酸切除修復(nucleotide excision repair,NER)途徑的限速步驟[4]。ERCC1基因定位于人染色體19q13.2，基因全長15 kb，含10個外顯子，編碼由297個氨基酸組成的蛋白質，其分子量為32.5 KD。

目前國內外關于胃癌組織中ERCC1蛋白表達的研究有報道，其結果顯示[5]胃癌組織中存在不同程度的ERCC1蛋白表達低下或缺失。但針對胃癌組織中ERCC1基因甲基化的情況缺乏系統性研究。本研究采用甲基化特異性PCR技術檢測30例胃癌組織、相應癌旁組織及10例正常胃組織中ERCC1基因甲基化狀況，結果顯示胃癌組織的甲基化率為76.7%，顯著高于癌旁組織中該基因的甲基化率13.3%，差異有統計學意義(P<0.05)。10例正常胃組織均未檢測到甲基化的發生。

綜上所述，胃癌組織中存在高比例的ERCC1基因甲基化，為下一步研究ERCC1基因甲基化是否具有一定的臨床意義打下了理論基礎。

[1] Ali Z,Deng Y,Ma C.Progress of research in gastric cancer 〔J〕.J Nanosci Nanotechnol,2012,12(11):8241-8248.

[2] 尹紅英,王紅兵.耐紫杉醇人肺腺癌A549細胞株中BRCA1基因啟動子CpG島甲基化的研究 〔J〕.實用癌癥雜志,2012,27(4):337-338.

[3] Jones PA,Baylin SB.The epigenomics of cancer 〔J〕.Cell,2007,128(4):683-692.

[4] Croteau DL,Peng Y,Van Houten B.DNA repair gets physical:mapping an XPA-binding site on ERCC1 〔J〕.DNA Repair (Amst),2008,7(5):819-826.

[5] Liu WB,Ao L,Cui ZH,et al.Molecular analysis of DNA repair gene methylation and protein expression during chemical-induced rat lung carcinogenesis 〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2011,408(4):595-601.