羧甲基賴氨酸對人外周血單核細胞破骨樣轉化的影響

魏芹,金虹,任曉妹,蔣益波,劉乃豐

(1.東南大學醫學院,江蘇 南京 210009; 2.東南大學附屬中大醫院 心內科,江蘇 南京 210009; 3.泰興市人民醫院 心內科，江蘇 泰興 225400)

血管鈣化是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病和慢性腎病等疾病的共同病理基礎,與許多臨床事件密切相關[1- 3]。近年來的研究發現,血管鈣化是一個細胞介導的、類似于骨重構的主動調節過程。正常狀態下,血管內成骨成份和破骨成份處于平衡狀態,抑制血管鈣化,病理狀態下這種平衡被打破。我們課題組前期研究表明,晚期糖基化終產物(AGEs)促進血管平滑肌細胞鈣化,并在大鼠糖尿病血管鈣化模型基礎上證實AGEs促進血管鈣化[4- 6]。本研究探討AGEs的主要成分羧甲基賴氨酸(CML)對單核細胞破骨樣轉化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

外周血來源于健康成人,CML購買自法國SAS多肽實驗室,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒、細胞核因子κ B受體活化因子配基(RANK- L)和巨噬細胞集落刺激因子(M- CSF)均購自sigma公司,組織蛋白酶K抗體購自abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血單核細胞提取 無菌條件下抽取健康成人外周血,按照說明書,使用Ficoll液離心分離后吸取呈云霧狀的白膜層,離心棄上清液,加入α- MEM培養液重懸,調整單核細胞濃度為1×109L-1,接種于24孔培養板中,0.5 ml·孔-1,培養8 d。將細胞分為3組：30 ng·ml-1RANKL+25 ng·ml-1M- CSF誘導組(A組)，25 μg·ml-1CML+30 ng·ml-1RANK- L+25 ng·ml-1M- CSF干預組(B組)，空白對照組(C組)。

1.2.2 TRAP染色 染色方法按白細胞酸性磷酸酶試劑盒說明進行,配制孵育液,細胞固定后在染液中37 ℃孵育60 min,鏡下觀察。對每培養孔6個隨機視野中的TRAP染色陽性的破骨樣細胞(胞核≥3)進行計數。

1.2.3 Western blotting檢測組織蛋白酶K蛋白表達 培養8 d后提取細胞蛋白,經10% SDS- PAGE電泳,轉膜后封閉1h,加入2 μg·ml-1稀釋的抗小鼠單克隆組織蛋白酶K抗體雜交,4 ℃過夜后用辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠Ig G雜交,再洗膜顯色,圖像分析系統進行吸光度分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 光鏡下觀察細胞形態變化

培養3 d后,A組單核細胞出現融合趨勢,細胞體積變大,B組細胞融合現象較A組少,C組細胞形態及數量無明顯變化;8 d時B、C兩組出現少量的多核細胞,A組可見大量多核細胞,核的數目3～10個不等(圖1)。

2.2 TRAP染色結果

培養8 d時進行TRAP染色,光鏡下可見胞漿呈紅色、胞核呈淡黃色的TRAP陽性破骨樣細胞。A組TRAP陽性破骨樣細胞數量較多,而B、C兩組陽性破骨樣細胞數量均相對較少(圖2)。

2.3 TRAP陽性多核細胞計數

光鏡下對各組TRAP陽性破骨樣細胞進行計數。與C組比較,A組TRAP陽性破骨樣細胞數量明顯增多,而B組TRAP陽性破骨樣細胞數量較A組明顯減少(P<0.05)(圖3)。

2.4 組織蛋白酶K蛋白表達

Western blotting法檢測破骨樣細胞組織蛋白酶K蛋白表達量,以GAPDH為內參。與C組相比,A組組織蛋白酶K蛋白表達明顯增加,而B組組織蛋白酶K蛋白表達較A組明顯降低(P<0.05)(圖4)。

3 討 論

傳統的動脈粥樣硬化的危險因素有高血壓、吸煙、高膽固醇血癥、超重/肥胖、糖尿病等,但實際上許多發生心血管事件的人并沒有這些因素。例如,約有一半的心肌梗死患者沒有危險因素或沒有冠心病史,許多婦女在心源性猝死之前往往沒有任何先兆。因此,尋找新的危險因素愈發顯得重要。近年血管生物學的研究和心血管影像學的進展,發現血管鈣化與許多臨床事件密切相關。因此,血管鈣化越來越受到人們的重視,血管鈣化的機制研究亦顯得非常重要。

A.培養3 d,A組出現細胞融合; B.培養8 d,A組出現大量破骨樣細胞; C.培養8 d,B組破骨樣細胞數量較A組明顯減少;D.培養8 d,C組出現少量破骨樣細胞

圖1光鏡下觀察單核細胞破骨樣轉化過程中形態變化×200

A. Some mononuclear cells fused togethe in group A at day 3 after induction; B. A large number of osteoclast- like cells were founded in group A at day 8 after induction; C. A little osteoclast- like cells were founded in group B at day 8 after induction; D. A little osteoclast- like cells were founded in group C at day 8 after induction

Fig1Morphologychangeofosteoclast-likecellsafterinduction×200

圖2破骨樣細胞化學染色鑒定(TRAP染色×200)

Fig2Tartrate-resistantacidphosphatase(TRAP)stainingresultsofinducedosteoclast-likecells×200

與C組比較,aP<0.05；與A組比較,bP<0.05

圖3CML抑制人外周血單核細胞向破骨樣轉化

Fig3CMLinhibitsRANKL-inducedosteoclastogenesisinhumanperipheralbloodmonocytes

與C組比較,aP<0.05;與A組比較,bP<0.05

圖4CML抑制破骨樣細胞組織蛋白酶K的蛋白表達

Fig4CMLsupressesproteinexpressionofCathepsinKinosteoclast-likecells

血管平滑肌細胞是血管鈣化的主要參與細胞。在血管鈣化形成過程中,血管平滑肌細胞向成骨樣轉化被認為起關鍵作用,當前的研究也是聚焦在成骨樣轉化方面。但是近年來的研究發現,血管鈣化是一個細胞介導的、類似于骨重構的主動調節過程,正常狀態下,血管內成骨成份和破骨成份處于平衡狀態,抑制血管鈣化,病理狀態下這種平衡被打破。且已有研究發現在動脈粥樣硬化鈣化斑塊處確實存在破骨樣細胞證據。Jeziorska等[7]在動脈粥樣硬化鈣化斑塊處發現多核破骨樣細胞存在,但數量較少。Jaffer等[8]在動脈粥樣硬化鈣化斑塊處發現破骨細胞標志組織蛋白酶K。組織蛋白酶K為半胱氨酸蛋白酶家族的成員,是由成熟破骨細胞大量合成[9- 10],是破骨細胞標志性基因,可作為破骨細胞及其分化階段的標志,這種酶在破骨細胞降解Ⅰ型膠原時發揮了關鍵作用,骨吸收陷窩中骨無機相的溶解是有機相退化的前提條件,而這個過程主要由組織蛋白酶K參與[10]。研究表明,促血管平滑肌細胞成骨化的因子,如氧化低密度脂蛋白膽固醇、高磷同時可抑制巨噬細胞向破骨細胞分化[11- 12]。本研究從形態學上發現CML能夠抑制外周血單核細胞向破骨樣細胞轉化,同時抑制了破骨細胞標志基因組織蛋白酶K的表達,表明糖基化終產物(AGEs)主要抗原表位CML能夠抑制單核細胞破骨樣轉化,這是AGEs促進血管鈣化的又一個機制。本課題組將會通過在體水平深入研究CML對外周血單核細胞向破骨樣轉化的影響,為深入探討AGEs促進血管鈣化新機制提供理論依據。

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