ob/ob與野生型小鼠脂肪組織的磁共振波譜研究

彭新桂，柏盈盈，居勝紅

(東南大學附屬中大醫院 放射科,東南大學醫學院 分子與功能影像實驗室,江蘇 南京 210009)

研究發現脂肪組織的體積和分布是多種疾病的重要致病因素之一。并且,脂肪組織中脂肪酸成分不同也是影響各種疾病的誘因,包括癌癥[1]、2型糖尿病[2]和心血管疾病[3]。然而,研究脂肪組織內脂質成分和疾病的發病風險之間的關系非常困難,部分原因是由于傳統有創的活檢限制了研究的開展。13C磁共振(13C- MR)波譜相對于磁共振氫質子波譜(hydrogen magnetic resonance spectroscopy,1H- MRS),在檢測脂肪組織脂質成分方面可以提供更多的特征[4- 5],但是13C- MR由于其相對低敏感性、低空間分辨率和相對高的技術要求而限制了其廣泛使用。并且,隨著高場強MR儀的廣泛應用,1H- MRS的活體、非侵襲性測量脂質及操作相對簡單等優點有助于進一步的研究[6]。ob/ob鼠是研究肥胖和糖尿病常用的動物模型[7],本實驗采用7.0 T MR成像儀對ob/ob及野生型(wild type,WT)小鼠進行全身單次激發1H- MRS和單體素波譜采集,活體評價脂肪代謝異常ob/ob鼠及其野生對照組全身脂質含量、不同類型脂肪組織脂質成分。

1 材料與方法

1.1 材料

6只ob/ob(C57BL/OlaHsd- Lep)鼠購買于北京軍事科學實驗動物中心,雄性,10周齡,平均體重(47.5±1.54) g;6只對照組C57BL/6J鼠購買于上海動物模式中心,雄性,10周齡,平均體重(26±0.71) g;7.0 T小動物MR成像儀(Bruker PharmaScan,德國);異氟烷(山東科源制藥有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MR掃描

所有MR成像和1H- MRS采集均在7.0 T Micro MR成像設備上完成。所有小鼠MRI掃描期間均采用吸入麻醉,使用的吸入麻醉劑為異氟烷,與氧氣混合后誘導劑量為5%,維持劑量為1%～2%。小鼠頭先進俯臥于內徑3.5 cm鳥籠式發射與接受線圈內,同時連接呼吸門控監視呼吸節律及幅度,呼吸頻率保持25～35次·min-1,并予保溫。所有動物先后分別進行MR成像及1H- MRS采集。

全身1H- MRS波譜采集使用單個RF脈沖序列,重復時間為5 000 ms,射頻脈沖持續時間為10 ms,重復次數為32。計算整體的甘油三脂(triglyceride,TG)含量按照下列公式：TG含量=TG峰下面積/(水峰下面積+TG峰下面積)×100%。

常規T1加權成像(T1WI)提供準確的1H- MRS體素的定位。采用多層面多回波成像序列(multiple slices multiple echo, MSME),掃描參數： 重復時間為500.0 ms,回波時間為15.0 ms,翻轉角為180°,重復次數4次,無間距掃描。無脂肪抑制。成像范圍為從頸部至肛門,軸位掃描。

采集1H- MRS運用點分辨自旋回波波譜技術(point- resolved echo spin spectroscopy,PRESS),重復時間和回波時間分別為2 500 ms和20 ms;體素為2.0 mm×2.0 mm×2.0 mm,重復次數為512。體素分別放置在棕色脂肪(brown adipose tissue,BAT)和白色脂肪(white adipose tissue,WAT),具體放置位置：BAT主要選擇頸肩部肩胛間區采集,WAT選擇下腹部生殖腺周圍,相應部位位于磁場中心。均需避開大血管及邊緣部位。采集前先自動勻場,使被選體素區域磁場均勻性最優化,在體波譜采集均不壓水,水峰半高寬<45 Hz。在Topspin軟件上將采集的自由感應式衰減信號進行傅立葉轉換,再將基線和相位矯正后進行分析。波譜數據分析時,首先確定4.7 ppm水峰為參考峰,將這個參考峰的峰下面積固定為1,所有其他峰的積分值都隨之標準化。按下列公式計算脂質含量(FC)：FC=100%×B峰下面積 /(水峰下面積+B峰下面積)

TG峰為B峰,位于1.3 ppm,計算TG在總體氫質子中所占百分比。水峰的化學位移為4.6～4.8 ppm,TG峰的化學位移為1.2～1.4 ppm，計算公式參照文獻[8]。

分別計算飽和脂肪酸(fraction of saturated fatty acids,FS)、不飽和脂肪酸(fraction of unsaturated fatty acids,FU)、雙不飽和脂肪酸(fraction of diunsaturated fatty acids,FDU)含量及多聚不飽和程度(polyunsaturation degree,PUD),A峰的化學位移為0.8～1.0 ppm,D峰的化學位移為1.9～2.1 ppm,E峰的化學位移為2.1～2.3 ppm,F峰為2.7～2.9 ppm，計算公式如下[8- 9]：FU=D峰下面積/(2×E峰下面積);FS=1-FU;FDU=F峰下面積/E峰下面積;PUD=F峰下面積/(2/3)A峰下面積。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 整體1H- MRS測量TG含量

單次激發1H- MRS可以在活體上整體定量脂質蓄積程度。全身波譜顯示兩個峰：一個水峰在4.7 ppm,一個是TG峰在1.3 ppm。ob/ob鼠TG氫質子含量占總體氫質子含量的52.93%±3.66%,而WT鼠為7.88%±0.79%,ob/ob鼠顯著高于WT鼠,兩者間差異有統計學意義(P<0.001)(圖1)。

圖1全身單次激發1H-MRS波譜圖及全身TG含量比較

Fig11H-MRSofallbodywithasingleradiofrequencypulsesequence

2.2 單體素1H- MRS定量WAT及BAT的脂質含量及成分分析

分別采集分析頸肩部BAT及生殖腺周圍WAT的1H- MRS(圖2)。ob/ob鼠和WT鼠BAT的脂質含量分別為93.1%±1.6%、74.4%±1.6%;兩組鼠WAT的脂質含量分別為95.6%±1.6%、90.7%±4.8%,測量結果顯示ob/ob鼠BAT的脂質含量顯著高于WT鼠(P<0.05),但是兩組鼠WAT的脂質含量差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。HE染色結果顯示,WT鼠BAT脂肪細胞較小,血管豐富,而ob/ob鼠BAT脂肪細胞內見多量脂滴,較WT鼠脂肪細胞體積明顯增加,血管較稀疏;兩者WAT形態基本一致,但是ob/ob鼠WAT細胞較WT鼠體積明顯增大(圖3)。

圖21H-MRS采集BAT和WAT體素放置位置(A)及波譜圖(B)

Fig2Thevoxelof1H-MRSinBATandWAT

Tab 1 The lipid contents of the BAT and WAT in vivo by MRI and %

ob/ob鼠WAT的PUD低于野生對照組,分別為0.236±0.043和0.309±0.043(P<0.05);ob/ob鼠WAT的FDU也低于對照組,分別為0.211±0.023和0.297± 0.035(P<0.05),但是ob/ob鼠WAT的FU與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05),ob/ob鼠BAT的PUD、FU及FDU與對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

ob/ob鼠WAT的FDU低于BAT的FDU,分別為0.211±0.023和0.249±0.048,差異有統計學意義(P<0.05);ob/ob鼠WAT與BAT的PUD分別為0.236±0.043、0.272±0.063,FU分別為0.774±0.063、0.743±0.069,差異均無統計學意義(P>0.05)。WT鼠WAT的FU高于BAT,分別為0.789±0.063和0.681±0.039,差異有統計學意義(P<0.05);WT鼠WAT與BAT的PUD及FDU間差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

圖3BAT及WAT的HE染色結果×200

Fig3HEstainingofBATandWAT×200

表2WAT和BAT活體1H-MRS脂肪成分分析(n=6)

Tab2ThelipidcomponentanalysisinBATandWATinvivobyusing1H-MRS(n=6)

鼠 別WATBATPUDFUFDUPUDFUFDUob/ob鼠0.236±0.0430.774±0.0630.211±0.0230.272±0.0630.743±0.0690.249±0.048aWT鼠0.309±0.0430.789±0.0630.297±0.0350.341±0.0680.681±0.039a0.262±0.053t值-3.453-0.496-6.574-1.6701.713-0.392P值0.0030.6250.0000.1330.1300.705

與WAT比較,aP<0.05

3 討 論

3.1 單次激發1H- MRS評價小鼠全身脂質含量

脂肪組織分布全身,受性別、年齡、飲食、體育鍛煉、激素及藥物[10]等因素影響,同時,脂肪分布的部位不同引起心血管風險因素的關聯度顯著不同[11]。ob/ob鼠純合子缺乏瘦素mRNA的表達導致無義突變,從而引起無活性的瘦素增加。瘦素在調節體重、脂肪沉積及能量代謝方面均發揮重要作用,除了在能量儲備上起非常重要的作用外,在調節脂肪酸及葡萄糖代謝上也起關鍵作用[12- 13]。脂肪組織單次激發1H- MRS使活體非侵襲性整體定量研究脂質累積程度成為可能,檢測結果顯示ob/ob鼠TG含量顯著高于WT鼠。研究也證實,在MRI上測量全身WAT體積,結果表明ob/ob鼠顯著高于正常對照組[6,9]。該方法測量全身脂質含量比整體光密度測量法或同位素測量法更簡便易行,可以成為評價肥胖的一個敏感指標[14]。

3.2 單體素1H- MRS評價WAT及WAT脂質含量及脂質成分

根據脂肪組織的不同功能和顏色分為WAT和BAT。WAT的主要功能是以TG形式儲存能量,在食物不足時,為了代謝需要動員儲存的TG。而 BAT的主要功能是能量消耗和產熱[15]。形態學上,WAT細胞內含有單一大脂滴,而BAT細胞是多房腔的,包含多重脂滴。BAT不同于WAT，含有豐富的血管和神經支配。BAT由于含有豐富的血管和稠密的線粒體而呈棕色。在寒冷誘導下,BAT快速上調解耦連蛋白Ucp1活力,促使BAT細胞質子轉運和分解ATP產生熱能。在小型哺乳動物,BAT活力受損被認為在脂肪代謝異常和代謝綜合征中起重要作用。同時,WAT和BAT都含有調節脂質合成、水解和分泌激素的酶類,例如瘦素,調節能量動態平衡。因而活體檢測WAT及BAT變化顯得尤為重要[16]。

在胚胎形成第15天,在肩胛間區BAT結構就已形成,而WAT在出生后形成,主要位于腹股溝、腹膜后、性腺、腸系膜和皮下。頸部及肩胛間區在解剖上是BAT組織的分布范圍,由于ob/ob鼠與WT鼠的BAT的血管含量及脂肪細胞內脂滴不一致,單體素MRS方法測量BAT中脂肪和水的含量也不同,ob/ob鼠與WT鼠BAT的脂肪含量分別為93%和74%,ob/ob鼠BAT脂肪含量顯著高于WT鼠,組織病理學上也證實ob/ob鼠BAT脂肪細胞內存留大量的脂滴,脂肪細胞明顯增大,而WT鼠BAT脂肪細胞小,存儲的脂滴少,血管豐富。但是WT鼠頸部及肩胛間區BAT體積較小,MRS的體素內可能包含周圍肌肉等其他組織而影響數據的準確性。

單體素1H- MRS在7.0 T場強下能夠采集化學位移0.9～5.3 ppm范圍內10個峰,可以計算FS、FU、FDU含量及PUD。單體素1H- MRS體外實驗研究[17]表明,測量100%油的FS及FU相對含量,分別為0.15和0.85,與實際脂肪成分數據一致(脂肪100%, FS 15 g, FU 85 g);同時測量PUD為0.03,這對應用于活體進行脂肪的定性研究非常重要,其不同的含量有著不同的病理生理意義：不同的脂肪代謝異常情況下脂肪組織FS及FU的相對含量會發生改變;不同脂肪組織如WAT和BAT的PUD也有不同,并且在生理狀態下,PUD還受年齡、飲食及生存環境等因素影響。ob/ob鼠和WT鼠的內臟WAT組織的PUD分別為0.24和0.31。Calderan等[9]測量ob/ob鼠皮下WAT的PUD,結果為0.524 7;而Lanati等[18]測量WT大鼠皮下WAT的PUD為0.68。由此證實,PUD受不同類型、不同部位脂肪組織、不同品系等多種因素影響。文獻[19]報道,1H- MRS測量皮下脂肪組織中FS為27%～29%,FDU為23%～24%,本實驗結果顯示內臟WAT和BAT FS為21%～32%,FDU為21%～28%,并且顯示ob/ob鼠WAT FDU高于WT鼠,ob/ob鼠WAT FDU高于BAT。Ren等[19]利用活檢組織氣相色譜分析(金標準)檢測人皮下及骨髓脂肪組織FDU的含量為17%～18%,而波譜測量結果為23%～24%,較金標準檢測結果高估。可能的原因主要有以下3個：(1) 大分子或含水代謝產物的化學位移與脂質的化學位移有所重疊;(2) 幾種不同脂肪酸的活體氫質子波譜信號有輕度不同化學位移;(3) T2矯正是非常關鍵的,甚至比T1矯正更為重要。所以,1H- MRS需要進一步改善采集及后處理方法。

單次激發全身1H- MRS及單體素1H- MRS不僅可以實現活體觀察全身脂質含量及脂肪組織脂質含量,也可以分析不同脂肪組織中脂質成分的動態變化,7.0 T1H- MRS因其簡單、快速、無創、無痛等優點成為進一步研究脂質代謝的新方法。

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