玉屏風散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠免疫調節的影響

張露蓉，姚霏，江國榮

(蘇州市中醫醫院 中醫藥研究所，江蘇 蘇州 215009)

大量的免疫學研究證明，腫瘤一旦在機體內發生發展，機體的免疫系統可能通過多種途徑參與抗腫瘤的免疫效應，以消除腫瘤細胞或控制腫瘤的生長。中醫藥抗腫瘤的免疫機制多與其提高機體免疫有關[1-4]，如增加巨噬細胞吞噬能力、自然殺傷細胞的殺傷能力，促進淋巴因子、白細胞介素-2(IL-2)的產生，增加T細胞表面IL-受體(IL-2R)的表達、促進T細胞增殖，糾正T細胞亞群紊亂等。

玉屏風散由黃芪、白術、防風組成，具有扶正固表、標本兼治的治療作用，是增強衛氣的首選方劑。現代醫學認為衛氣與免疫功能緊密相關，藥理學研究也證明玉屏風散具有廣泛的免疫調節作用[5-6]，但其對腫瘤狀態下的機體免疫調節報道很少[7-8]。作者所在實驗室前期研究結果表明，玉屏風散可抑制Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠腫瘤生長，該作用是增強機體免疫和微弱的直接誘導腫瘤細胞凋亡的綜合效應(另文發表)。本研究在保證玉屏風散一定抑瘤效應的前提下，觀察與分析玉屏風散對肝癌小鼠機體免疫的調節作用及促進抗肝癌免疫反應的特點，為玉屏風散在臨床抗肝癌中的合理應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF級近交C57BL/6純系小鼠，雄性，體重18～22 g，購自蘇州愛爾麥特科技有限公司實驗動物中心，許可證號：SCXK(蘇)2009-001。

1.1.2 實驗藥物 玉屏風散，由黃芪、白術、防風組成。黃芪、白術購自蘇州市春暉堂藥業有限公司，批號均為100601；防風購自蘇州市天靈中藥飲片有限公司，批號101115-1。按黃芪∶白術∶防風為3∶1∶1的比例，加入8倍量低溫水，浸泡0.5 h，回流提取2次，每次1 h。合并兩次濾液,濃縮，得濃度為1.0 g生藥·ml-1濃縮液，-4 ℃密封保存備用。

1.1.3 試劑 DMEM培養液(GIBCO公司，批號1320158)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號100511)，氟化鈉(上海化學試劑供應站，批號890425)，FITC的小鼠CD4抗體(eBioscience，批號E00078-133)，PerCP-Cy5.5的小鼠CD8a抗體(eBios-cience，批號E08300-1630)，FITC的小鼠CD11b抗體(eBioscience，批號E033742)，APC的小鼠CD19抗體(eBioscience，批號E030718)，PE的小鼠CD80抗體(eBioscience，批號E01355-1630)，順鉑(凍干型，山東齊魯制藥有限公司，批號0070171DB)，香菇多糖注射液(金陵藥業股份有限公司福州梅峰制藥廠，批號101001-1)，碳酸氫鉀、氯化銨、EDTA-Na2等試劑(均為國產分析純)。

1.1.4 主要儀器 賀利二氧化碳培養箱(美國科峻儀器公司)，Leica DMIL倒置顯微鏡(德國萊卡儀器有限公司)，Z 320 K低溫高速離心機(德國HERMLE公司)，電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 小鼠肝癌細胞株Hepa1-6由蘇州大學生物醫學研究院惠贈，采用含體積分數10%胎牛血清的DMEM(pH 7.0)完全培養液，在37 ℃、體積分數5%CO2條件下常規培養。

1.2.2 Hepa-6肝癌荷瘤小鼠模型的建立和分組處理 小鼠適應性飼養3 d后用于種瘤。取對數生長期的Hepa1-6細胞，消化后用PBS稀釋成1× 107ml-1的細胞懸液，接種于小鼠右腋皮下，每只接種體積為0.2 ml。當捫及接種小鼠皮下結節直徑約達5 mm時進行隨機分組，分為模型對照組(生理鹽水組)， 陽性藥順鉑組(5 mg·kg-1)和香菇多糖組(1.25 mg·kg-1)，玉屏風散20、25、30 g生藥·kg-1組，每組5只小鼠。分組當天開始給藥，順鉑組每3 d腹腔注射1次；其余組每日灌胃2次(間隔12 h進行)。連續給藥兩周，末次給藥12 h后稱重，放血后斷髓處死小鼠。解剖剝離瘤體、脾臟和胸腺，稱重并記錄。分別計算抑瘤率、脾臟指數和胸腺指數。計算公式：抑瘤率=[1-(藥物組平均瘤質量/模型對照組平均瘤質量)]×100%；脾臟指數=脾臟質量(mg)/小鼠體重(g)×10；胸腺指數=胸腺質量(mg)/小鼠體重(g)×10。

1.2.3 脾細胞懸液的制備 取稱重后的小鼠脾臟，剪碎，在毛玻片上磨細，過200目尼龍網，收集濾液，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入10～15 ml紅細胞裂解液，混懸脾細胞，靜置10～20 min后1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，再用PBS洗1遍細胞，最后加1 ml流式細胞緩沖液重新懸浮細胞。以上操作均在冰上進行。

1.2.4 免疫熒光標記法測定細胞亞群 于96孔板中加入50 μl 用流式細胞緩沖液懸浮好的脾細胞(每孔1×105～1×106個細胞)，加入50 μl已經用流式細胞緩沖液稀釋好的各抗體(CD4、CD8、CD11b、CD19和CD80)，混勻后4 ℃避光孵育30 min。每孔加入200 μl 流式細胞緩沖液洗滌細胞3遍，1 200 r·min-1離心5 min，棄200 μl上清。再加200 μl 流式細胞緩沖液，轉移到流式管中，流式細胞儀檢測。每個樣本收集10 000個細胞用于數據分析，采用FLOWJO軟件處理樣品數據。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 玉屏風散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制

與模型對照組比較，玉屏風散組的腫瘤質量呈現下降趨勢，且具有一定的劑量依賴性(玉屏風散20、25和30 g生藥·kg-1組的抑瘤率依次為18.86%、28.81%和37.44%)；其抑瘤效應與香菇多糖組(35.19%)相近，明顯弱于順鉑組(54.19%)。見圖1，提示玉屏風散可抑制Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長。

1.模型對照組； 2.順鉑組； 3.香菇多糖組； 4.玉屏風散20 g生藥·kg-1組； 5.玉屏風散25 g生藥·kg-1組； 6.玉屏風散30 g生藥·kg-1組； a 與模型對照組比較，P<0.05

圖1玉屏風散對Hepa1-6肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用

Fig1YPFsuppressedthetumorgrowthintheHepa1-6hepatoma-bearingmice

2.2 玉屏風散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠胸腺和脾臟的影響

與模型對照組相比，玉屏風散組胸腺質量和胸腺指數均無顯著變化；脾臟質量和脾臟指數呈現上升趨勢，玉屏風散30 g生藥·kg-1組較模型對照組差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表明玉屏風散在抑制腫瘤時對脾臟有促進作用，但對胸腺無影響。

2.3 玉屏風散對Hepa1-6肝癌小鼠脾臟中B細胞活化的影響

以CD19+代表B細胞，CD19+CD80+代表活化的B細胞分析：與模型對照組相比，玉屏風散組CD19+B細胞比例無變化，但其數量有所增加；其中玉屏風散25、30 g生藥·kg-1組CD19+B細胞數量顯著增加(P<0.05)。見圖3。進一步研究顯示，玉屏風散25、30 g生藥·kg-1組CD19+CD80+細胞比例顯著增加(P<0.01)。結果顯示玉屏風散使用后可促進肝癌小鼠脾臟中B細胞的活化，提示玉屏風散能夠促進腫瘤狀態下體液免疫細胞的活化。

A B

A.玉屏風散對胸腺和脾臟質量的影響； B.玉屏風散對胸腺和脾臟指數的影響； 1.模型對照組； 2.玉屏風散20 g生藥·kg-1組； 3.玉屏風散25 g生藥·kg-1組； 4.玉屏風散30 g生藥·kg-1組； a 與模型對照組比較，P<0.05

圖2玉屏風散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠胸腺和脾臟的影響

Fig2EffectofYPFontheweightandcoefficientofthymusandspleenintheHepa1-6hepatoma-bearingmice

A.Effect of YPF on the weight of thymus and spleen； B.Effect of YPF on the coefficient of thymus and spleen

A B C

A.玉屏風散對CD19+B細胞比例的影響； B.玉屏風散對CD19+B細胞數量的影響； C.玉屏風散對CD19+CD80+B細胞比例的影響；與模型對照組比較：aP<0.05，bP<0.01

圖3玉屏風散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠脾臟B細胞的影響

Fig3EffectofYPFonthespleenBcellsintheHepa1-6hepatoma-bearingmice

A.Effect of YPF on the CD19+B cells proportion；B. Effect of YPF on the CD19+B cells number；C.Effect of YPF on the CD19+CD80+B cells proportion

2.4 玉屏風散對Hepa1-6肝癌小鼠脾臟中巨噬細胞的影響

以CD11b+代表活化的巨噬細胞，與模型對照組比較，玉屏風散組脾巨噬細胞比例和數量均增加，其中玉屏風散20、30 g生藥·kg-1組差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01，圖4)。結果顯示玉屏風散使用后可增加肝癌小鼠的脾巨噬細胞比例和數量，且隨著劑量增大有所增加，提示玉屏風散能促進腫瘤狀態下非特異性免疫細胞的活化。

2.5 玉屏風散對Hepa1-6肝癌小鼠T細胞的影響

2.5.1 玉屏風散對Hepa1-6肝癌小鼠脾臟中T細胞的影響 與模型對照組比較，玉屏風散組脾臟中CD4+T和CD8+T細胞比例均無變化(P>0.05)；而CD4+T和CD8+T細胞數量均為增加，其中玉屏風散25、30 g生藥·kg-1組差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖5。結果表明玉屏風散使用后，可增加肝癌小鼠脾臟中的T細胞數量。

2.5.2 玉屏風散對Hepa1-6肝癌小鼠腫瘤中T細胞的影響 與模型對照組比較，玉屏風散組腫瘤組織中

A B

A.玉屏風散對巨噬細胞比例的影響； B.玉屏風散對巨噬細胞數量的影響； 與模型對照組比較：aP<0.05，bP<0.01

圖4玉屏風散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠脾臟中巨噬細胞的影響

Fig4EffectofYPFonthespleenmacrophagecellsintheHepa1-6hepatoma-bearingmice

A.Effect of YPF on the macrophage cells proportion； B.Effect of YPF on the macrophage cells number

A B

A.玉屏風散對CD4+和CD8+T細胞比例的影響； B.玉屏風散對CD4+和CD8+T細胞數量的影響； 1.模型對照組； 2.玉屏風散20 g生藥·kg-1組； 3.玉屏風散25 g生藥·kg-1組； 4.玉屏風散30 g生藥·kg-1組； a與模型對照組比較，P<0.05

圖5玉屏風散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠脾臟中CD4+T和CD8+T細胞的影響

Fig5EffectofYPFonthespleenCD4+TandCD8+TcellsintheHepa1-6hepatoma-bearingmice

A.Effect of YPF on the CD4+and CD8+T cells proportion； B.Effect of YPF on the CD4+and CD8+T cells number

CD4+T和CD8+T細胞比例均顯著增加(P<0.05，P<0.01，圖6)，表明使用玉屏風散可使腫瘤組織中T細胞比例增加，提示玉屏風散可能促進大量T細胞募集至腫瘤組織。

3 討 論

在整體抑瘤實驗中，玉屏風散20、25、30 g生藥·kg-13個劑量組均表現出一定的抑瘤作用，抑瘤率依次為18.86%、28.81%和37.44%，低于化療藥順鉑組的54.19%，與免疫增強劑香菇多糖組(35.19%)相近。而前期實驗結果顯示，玉屏風散25 g生藥·kg-1對Hepa1-6荷瘤裸鼠的腫瘤無抑制作用，30 g生藥·kg-1則呈現微弱的抑制作用(抑制率為9.55%)。裸鼠由于無胸腺，為免疫缺陷的小鼠。腫瘤移植于裸鼠，能保持其生物學特性，用于研究藥物直接殺傷腫瘤細胞的效應。而C57小鼠為免疫健全小鼠，其體現的藥物抗腫瘤效應為直接殺傷和免疫增強的綜合作用。因此，玉屏風散對裸鼠和C57小鼠抗肝癌效應的差異，可推測玉屏風散的抗肝癌作用主要是通過增強機體免疫功能而發揮的抑瘤效應。因此，本研究針對玉屏風散調節肝癌小鼠機體抗腫瘤免疫反應展開研究。

一些免疫抑制劑可使胸腺、脾臟等免疫器官萎縮；而免疫增強劑可使它們增重。因此，免疫器官質量的變化可作為觀察藥物對免疫影響的指標之一[9]。本研究選用中樞免疫器官胸腺和外周免疫器官脾臟，觀察肝癌小鼠給予玉屏風散后對它們質量及臟器指數的影響。結果顯示玉屏風散對胸腺質量和胸腺指數均無影響。胸腺是T細胞分化發育的場所，發育成熟的T細胞再經血液遷移到脾、淋巴結等。本研究同時觀察到玉屏風散可增加肝癌小鼠脾臟中的T細胞數量和腫瘤組織中的T細胞比例，推測玉屏風散在促進胸腺T細胞成熟的同時，可促進成熟T細胞向脾臟、腫瘤等遷移，表現出對肝癌小鼠胸腺無影響的現象。本研究還觀察到玉屏風散可以增高脾臟質量和脾臟指數，但脾臟質量和指數還不能完全反映免疫系統的活化程度，因此后續的流式細胞術檢測免疫細胞亞群的活化更能夠反映免疫系統的活化程度。

1.模型對照組； 2.玉屏風散20 g生藥·kg-1組； 3.玉屏風散25 g生藥·kg-1組； 4.玉屏風散30 g生藥·kg-1組； 與模型對照組比較：aP<0.05，bP<0.01

圖6玉屏風散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠腫瘤中CD4+T和CD8+T細胞比例的影響

Fig6EffectofYPFontheproportionofCD4+TandCD8+TcellsintheneoplastictissuesoftheHepa1-6hepatoma-bearingmice

CD19是B細胞表面的糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，在骨髓B祖細胞即開始表達，持續整個B細胞成熟期，是最早發現的B細胞系表面標志；而CD80在靜息B細胞不表達或低表達，在活化B細胞表達增強。CD11b是CD11c-β2整合素黏附分子，活化的巨噬細胞表面表達CD11b。因此，本研究選用CD19+CD80+和CD11b+分別作為B細胞和巨噬細胞的活化評價指標。研究結果顯示：使用玉屏風散，可顯著增加脾臟中CD19+細胞數量和CD19+CD80+細胞比例，以及活化的巨噬細胞比例和數量(P<0.05，P<0.01)，提示玉屏風散具有促進腫瘤狀態下B細胞和巨噬細胞的活化從而抑制腫瘤生長的效應。

目前認為機體抗腫瘤的免疫機制主要是細胞免疫，體液免疫通常僅在某些情況下起協同作用；而且發揮細胞免疫效應的免疫細胞主要包括T淋巴細胞、NK細胞、巨噬細胞等，其中T細胞介導的特異性免疫應答在對抗原性較強的腫瘤細胞所產生的免疫應答中起很重要的作用。本研究結果顯示，使用玉屏風散可增加肝癌小鼠脾臟中CD4+T和CD8+T細胞數量以及腫瘤組織中的比例(P<0.05，P<0.01)。表明玉屏風散在促進脾臟T細胞數量增多的同時，有助于T細胞募集至腫瘤組織等免疫效應，而發揮其抗腫瘤的作用。

綜上研究結果提示，玉屏風散的干預可促進肝癌荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫反應，提高其體液免疫和細胞免疫應答水平，從而發揮其抑制腫瘤生長的效應。玉屏風散通過以提高特異性細胞免疫為主的多環節、協同免疫調控，體現了玉屏風散“扶正固本，標本兼治”的巧妙組方。本研究為玉屏風散在臨床抗肝癌中的合理應用提供了實驗依據。

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