基于甲基乙烯基醚/馬來酸酐共聚物水凝膠三維培養卵巢癌細胞的研究

陳峻崧，陳登宇，竇駿，張天柱，楊翠萍，侍方方，顧寧

(1.東南大學醫學院 病原生物學與免疫學系，江蘇 南京 210009； 2.東南大學 生物科學與醫學工程學院，江蘇 南京 210096； 3.東南大學附屬中大醫院 腫瘤科，江蘇 南京 210009)

人體內組織為三維(three-dimensional，3D)結構，但是在研究人體組織結構功能時卻往往依賴體外的二維(two-dimensional，2D)培養和動物模型。過去常利用普通2D細胞培養來研究腫瘤發生發展機制，但此法與體內真實環境有很大不同，如細胞與基質間相互作用、細胞分化等[1]。而動物模型由于與人體存在種屬差異，不能很好地重復人體腫瘤生長轉移、藥物治療反應、免疫反應等特性，因此需要一種新的細胞培養方式能夠充分地模擬人體內環境。3D細胞培養技術則能適應這種需求，并具有普通2D細胞培養簡單易行的優勢。3D培養用途已在抗腫瘤藥物篩選領域得到了認可，將來有望成為腫瘤發生及轉移機制研究、抗腫瘤藥物篩選和腫瘤干細胞培養的標準方法[2]。

本研究課題組應用聚甲基乙烯基醚/馬來酸酐(PMVE-co-MAH)水解產物甲基乙烯基醚/馬來酸共聚物(PMVE-co-MA)和交聯劑聚乙二醇進行交聯反應，制得可適合用作多種腫瘤細胞3D培養基質的水凝膠TZ028和TZ029培養基[3]。通過對比市售商品化胞外基質(BME)膠和膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)3D培養基，研究人卵巢癌SKOV-3細胞在生長曲線、細胞遷移和侵襲、抗腫瘤藥物耐藥實驗等方面的差異度，確定自制的水凝膠是否像BME和膠原蛋白Ⅰ培養基一樣，可模擬體內細胞環境，為分析卵巢癌SKOV-3細胞生物學特性和藥物篩選等研究提供細胞3D培養模型。

1 材料與方法

1.1 材料

BME培養基(3D culture BME cell proliferatio,美國Trevigen公司，批號3445-096-K)，膠原蛋白Ⅰ培養基(3-D culture MatrixTMrat collagen Ⅰ，美國Trevigen公司，批號3447-020-01)，millicell聚酞酸酯嵌入式培養皿(millicell polycarbonate,美國Millipore公司)，人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，DMEM完全培養液為含體積分數10%胎牛血清(FBS Gibco公司)和1%青鏈霉素溶液的DMEM(Gibco公司)培養液。

1.2 方法

1.2.1 交聯多聚水凝膠為PMVE-co-MAH與交聯劑聚乙二醇PEG20000進行交聯反應 通過調整PMVE-W-MA中羧基和交聯劑中羥基的比例，獲得不同交聯密度的凝膠，交聯后凝膠中多余的羧基再用聚乙二醇單甲醚進行酯化，最后將獲得的凝膠配成0.1wt%～10wt%之間的水凝膠分散體系。TZ028和TZ029材料為PMVE-co-MAH與交聯劑聚乙二醇PEG20000分別按照羧基的量n-COOH∶羥基的量n-OH=128∶1和256∶1進行交聯所獲得的水凝膠[3]。

1.2.2 腫瘤細胞3D培養生長曲線 分別取TZ028和TZ029材料在冰上，用無菌滴管吸取50 μl(每孔)加入96孔板中，放入37 ℃、體積分數5%的 CO2培養箱中60 min孵育形成凝膠狀；用DMEM的完全培養基懸浮SKOV-3細胞計數到1×105個·ml-1；按組別分別加入TZ028和TZ029材料使其體積分數分別達到5%；快速取上述混合液100 μl(每孔)分別滴加入含有TZ028和TZ029材料的96孔板中，使得每孔細胞數達到1×104個；放入37 ℃、體積分數5%的CO2培養箱中培養。抽取樣品分別于第1、5、10、15、20 天加入20 μl(每孔)MTT溶液(5 mg·ml-1，即0.5% MTT)，放入培養箱中孵育4 h后，加入50 μl(每孔)SDS三聯溶解液。在酶聯免疫檢測儀570 nm處測量各孔的OD值，同時設置對照孔。

1.2.3 腫瘤細胞遷移和侵襲實驗 分別用35 μl(每孔)BME培養基和膠原蛋白Ⅰ培養基與TZ028和TZ029材料包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風干。Transwell小室上室加入100 μl的已經過3 d無血清培養的SKOV-3細胞懸液，每孔含有1×104個細胞；下室加入DMEM的完全培養基。放入培養箱中孵育24 h后，用棉簽拭去上室的細胞和凝膠，并用PBS沖洗2遍；于4%甲醛中固定，用0.4%的臺盼藍染色，顯微鏡下對穿透細胞進行計數。每孔隨機取5位點細胞計數，取平均值計數。

1.2.4 紫杉醇耐藥實驗 SKOV-3細胞分別加入含有BME培養基、 膠原蛋白Ⅰ培養基、TZ028和TZ029材料的96孔板中，每孔1×104個細胞；放入培養箱培養72 h。96孔板中按照組別加入含紫杉醇的DMEM的完全培養基100 μl(每孔)，使其終濃度分別達到100 μmol·L-1。培養箱中培養72 h后，加入20 μl(每孔)MTT溶液反應4 h，加入50 μl(每孔)SDS三聯溶解液。在酶聯免疫檢測儀570 nm處測量各孔的OD值，同時設置2D培養組及空白對照孔。

1.3 主要觀察指標

(1) SKOV-3細胞在TZ028和TZ029材料中生長情況，繪制生長曲線；

(2) 對比BME培養基和膠原蛋白Ⅰ培養基，研究SKOV-3細胞在TZ028和TZ029材料中的遷移、侵襲能力；

(3) 對比2D培養，SKOV-3細胞在TZ028、TZ029、BME培養基和膠原蛋白Ⅰ培養基中3D培養對紫杉醇的耐藥性研究。

1.4 統計學處理

以上實驗全部重復3次，取平均值，所有數據均采用SPSS 17.0統計分析軟件包進行處理，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

SKOV-3細胞在TZ028和TZ029培養基中培養72 h后，呈黏附、生長、增殖，形成細胞團塊結構(圖1A)，兩材料間無明顯差別。于第1～10天細胞團塊不斷增大，結構致密，細胞表現出快速生長狀態(圖1B)。第10～15天細胞增長處于平臺期，更換培養液已無法維持細胞團塊的進一步增長，細胞生長處于緩慢或停滯狀態(圖1C)。其后至第20天，由于3D培養基及更換培養液不能再繼續支持細胞團塊的生長和增大，細胞開始出現皺縮、凋亡(圖1D)。SKOV-3細胞生長曲線(圖2)顯示，TZ028和TZ029培養基中3D培養SKOV-3細胞至第10～15天，細胞生長狀態好，處于平穩階段，適合進行藥物篩選和腫瘤細胞學的相關研究。

圖1SKOV-3細胞在TZ029培養基中進行培養×100

A.第1天； B.第10天； C.第15天； D.第20天； 刻度單位：100 μm

Fig1ObservationofSKOV-3cellsculturedinTZ029(×100)

A.1st day; B.10th day; C.15th day; D.20th day； Scale bar:100 μm

圖2SKOV-3細胞在TZ028和TZ029培養基中3D培養的生長曲線

Fig2StandardgrowthcurvesofSKOV-3cells3DculturedinTZ028orTZ029

Transwell實驗結果表明，SKOV-3細胞在TZ028(圖3A)和TZ029(圖3B)培養基中表現出強于BME(圖3C)和類似于膠原蛋白Ⅰ(圖3D)培養基的細胞侵襲力(P>0.05)，說明對SKOV-3細胞遷移力的影響類似。經過特定區域的細胞計數結果(圖4)顯示，TZ028和TZ029培養基中SKOV-3細胞侵襲力優于BME培養基組(P<0.05)，但前兩者之間沒有差異(P>0.05)。表明TZ028和TZ029培養基與市售的3D培養基相比，能夠模擬體內的腫瘤細胞遷移和侵襲所需的內環境。由于市售的BME培養基的濃度(15.04 mg·ml-1)大于膠原蛋白Ⅰ培養基(10 mg·ml-1)，SKOV-3細胞為較大體積腫瘤細胞(直徑范圍50～70 μm)難以快速地在BME培養基中遷移，表現出Transwell實驗結果數值明顯低于其他材料組。

圖3SKOV-3細胞Transwell實驗×100

A.TZ028組； B.TZ029組； C.BME組； D.膠原蛋白Ⅰ組； 刻度單位：100 μm

Fig3OpticalmicroscopeimagesofmigratedSKOV-3cellsthroughTZ028，TZ029，CollagenⅠ，andBMEhydrogel(×100)

A.TZ028; B.TZ029; C.BME hydrogel; D.CollagenⅠ；Scale bar:100 μm

紫杉醇耐藥實驗結果(圖5)表明，SKOV-3細胞在TZ028和TZ029材料中形成3D結構對紫杉醇的耐藥性要高于2D細胞培養模型(P<0.05)。而在不同的3D培養基中培養的SKOV-3細胞針對紫杉醇的耐藥性無明顯差別，表現為TZ028和TZ029材料與BME和膠原蛋白 Ⅰ 培養基耐藥結果上差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

為了克服卵巢癌耐藥和提高療效，臨床上越來越多地使用藥物聯合治療方案[4-6]，但是怎樣才能尋找到最佳的聯用方案？在開展昂貴的臨床試驗前，模擬體內環境的3D培養模型可能成為方便快速的篩選聯合用藥最佳方案[7]。3D培養模型中候選藥物與腫瘤基質相互作用的研究，可能會有助于分析腫瘤細胞對藥物敏感性和耐藥性的實際情況。到目前為止，用于腫瘤細胞3D培養的主要是動物性凝膠，如膠原蛋白Ⅰ[8]、明膠[9]、BME提取的BME 膠[10]、少量的合成生物材料如多孔微球或功能化葡聚糖等[11-12]。商業產品如Trevigen公司的膠原蛋白Ⅰ和BME 膠，BD公司的Matrigel 膠，大多都取自鼠尾腫瘤組織或其他動物組織。動物性凝膠的優勢在于適合腫瘤細胞的3D生長，但缺點也較明顯。如其中含有大量的未鑒定成分，批次間存在差異，影響了對腫瘤細胞的客觀和精確的評價；此外，動物性凝膠價格相對昂貴，不利于推廣和大規模化應用。合成生物材料中應用最廣泛的是水凝膠[13-14]，因為水凝膠材料能夠比較真實地模擬天然細胞外微環境的很多特征，所以水凝膠類支架材料引起了廣泛的注意。PMVE-co-MAH及其水解產物PMVE-co-MA是對人體和動物無毒無害的高分子材料，具有良好的化學穩定性和生物相容性優點，在醫藥衛生領域中有著非常廣泛的應用，如作為藥用黏合劑和緩釋劑等。本研究自制了TZ028和TZ029材料，一種類似于3D培養的水凝膠，用于SKOV-3細胞若干特性的研究，并與市售BME膠和膠原蛋白Ⅰ膠培養基對比，試圖以此水凝膠替代商品化的3D培養基。

aP<0.05； bP>0.05

圖4SKOV-3細胞Transwell實驗細胞計數

Fig4ThenumberofmigratedSKOV-3cellsthroughTZ028，TZ029，collagenⅠ，andBMEhydrogelinappointedarea

aP<0.05; bP>0.05

圖5SKOV-3細胞在不同3D培養和2D培養條件下對紫杉醇耐藥實驗比較

Fig5EvaluationofthechemoresistanceeffectofTaxolonSKOV-3cellsindifferent3Dculturesystermversus2Done

應用PMVE-co-MAH水解產物PMVE-co-MA和交聯劑聚乙二醇進行交聯反應，制得可適合用作多種腫瘤細胞3D培養基質的水凝膠。本研究結果顯示，SKOV-3細胞可以在TZ028和TZ029 3D培養的水凝膠中黏附、生長、增殖，形成細胞團塊結構，第10～15天時達到平臺生長期，第15～20天后出現凋亡。提示第10～15天3D細胞培養為最佳細胞模型期，可進行腫瘤細胞生物學、抗腫瘤藥物篩選等多項研究。SKOV-3細胞在TZ028和TZ029水凝膠培養中表現出與膠原蛋白Ⅰ培養基相似的細胞侵襲力，且優于BME培養基。在紫杉醇耐藥實驗中，TZ028和TZ029 3D培養的SKOV-3細胞表現出與膠原蛋白Ⅰ培養基和BME3D培養類似的耐藥性，明顯比2D培養的SKOV-3細胞更為耐藥(P<0.05)。本研究提示，自制的TZ028和TZ029水凝膠與市售的BME培養基和膠原蛋白Ⅰ培養基對細胞遷移和侵襲的影響作用相比，要優于或類似于市售產品，體現較好的生物相容性和體內環境的模擬性。在本實驗室，另外一組實驗采用人卵巢癌細胞HO8910細胞株，在TZ028和TZ029水凝膠與市售的BME培養基及膠原蛋白Ⅰ培養基的對比研究中，也取得了類似的結果[3]。TZ028和TZ029水凝膠材料與現有的生物來源的細胞3D培養材料相比具有成本更低、生產批次間質量差異小的優點以及多種細胞培養的可重復性，形成的3D培養環境更接近于體內環境。對于藥物研究和新藥篩選具有更為準確的預測作用，有望廣泛應用于醫藥領域抗腫瘤藥物的高通量篩選。

[1] NELSON C M，BISSELL M J.Of extracellular matrix，scaffolds，and signaling:tissue architecture regulates development，homeostasis，and cancer[J].Annu Rev Cell Dev Biol，2006，22:287-309．

[2] 陳峻崧，竇駿.腫瘤細胞及腫瘤干細胞3D培養應用研究進展[J].中國免疫學雜志，2010，26(10):953-956．

[3] ZHANG T Z，CHEN J S，ZHANG Q Y，et al.Poly(ethylene glycol)-cross linked poly(methyl vinyl ether-co-maleicacid)hydrogels for three-dimensional human ovarian cancer cell culture[J].Colloids and Surfaces A:Physicochem Eng Aspects，2013，422:81-89．

[4] CANNISTRA S A.Cancer of the ovary[J].N Eng J Med，2004，351:2519-2529．

[5] ATTAR R，ATTAR E.Use of hematopoietic stem cells in obstetrics and gynecology[J].Transfus Apher Sci，2008，38:245-251．

[6] CHEN J S，WANG J，CHEN D Y，et al.Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures[J].BMC Cell Biology，2013(14):7．

[7] WEIGELT B，BISSELL M J.Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer[J].Semin Cancer Biol，2008，18(5):311-321．

[8] BESSEA L，COULOMB B，LEBRETON-DECOSTER C，et al.Production of ordered collagen matrices for three-dimensional[J].Biomaterials，2002，23(1):27-36．

[9] WANG L S，CHUNG J E，CHAN P P，et al.Injectable biodegradable hydrogels with tunable mechanical properties for the stimulation of neurogenesic differentiation of human mesenchymal stem cells in 3D culture[J].Biomaterials，2010，31(6):1148-1157．

[10] WEAVER V M，LELIEVRE S，LAKINS J N，et al.Beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium[J].Cancer Cell，2002，2(3):205-216．

[11] 張啟英，張天柱，胡克，等.多孔微球在三維細胞培養中的研究進展[J].東南大學學報：醫學版，2013，32(1):90-94．

[12] 朱長皓，張天柱，胡克，等.功能化葡聚糖用于三維細胞培養及發展前景[J].東南大學學報：醫學版，2013，32(1):80-84．

[13] 孟慶斌，劉克良.肽類自組裝研究進展[J].化學進展，2009，21(11):2411-2422．

[14] 劉子佳，米坤，千貴俠，等.自組裝納米短肽RADAl6-I水凝膠在腫瘤細胞三維培養中的應用[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(8):1468-1471．