腦缺血再灌注后大鼠CIDE-B表達(dá)對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響

柳治國(guó) 李 夏 陳 燕

(山東勝利石油管理局濱南醫(yī)院放射科，山東 濱州 256601)

DNA片段裂解因子45(DFF45)是DNA裂解因子中的亞單位，具有抑制凋亡的作用〔1，2〕。誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的DFF45樣效應(yīng)因子(CIDE)的N-端與DFF45的N-端具有高度同源性〔3，4〕。CIDE-N結(jié)構(gòu)是這一家族蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，主要通過(guò)分子之間的鹽鍵發(fā)揮作用，起功能的調(diào)節(jié)作用。正常情況下，DFF45與DFF40的N-端均形成了一個(gè)中心結(jié)構(gòu)域〔5〕，但如果沒(méi)有DFF45的存在，新產(chǎn)生的DFF40得不到正確的構(gòu)形，即使出現(xiàn)凋亡信號(hào)也不能成為活性分子〔6〕。CIDE誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基團(tuán)在其C端，而調(diào)節(jié)部位則在N端〔7〕，N端發(fā)生突變或只有C端的突變體，失去可以調(diào)節(jié)的部位，表現(xiàn)出更強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)特性。CIDE-B定位于線粒體內(nèi)，有同源二聚體和異源二聚體兩種分子形式。線粒體的定位和分子結(jié)構(gòu)的二聚化是CIDE-B發(fā)揮作用的必要條件〔8.9〕。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，探討CIDE-B表達(dá)在神經(jīng)凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組 健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠144只，2月齡，體質(zhì)量220～240 g, 由青島市藥檢所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔SCXK(魯)2009-1010〕。隨機(jī)分為假手術(shù)組36只，腦缺血30、90、120 min各36只。按不同時(shí)間分為再灌注6 h、1、3、7、14、28 d 6個(gè)亞組，6只/亞組。

1.2腦缺血/再灌注模型 參考Pulsinelli等〔10〕四動(dòng)脈阻斷法建立大鼠全腦缺血再灌注模型。用10%水合氯醛(1 ml/kg)腹腔注射麻醉，俯臥固定，頸正中切口，暴露第1頸椎雙側(cè)翼孔，燒灼椎動(dòng)脈，分離并用無(wú)創(chuàng)傷動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成全腦缺血30、90、120 min后開(kāi)放雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾，再灌注時(shí)間6 h、1 、3 、7、14 、28 d。假手術(shù)組只暴露第1頸椎雙側(cè)翼孔而不燒灼椎動(dòng)脈，僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈不做阻斷和夾閉。模型成功標(biāo)志：夾閉頸總動(dòng)脈30、90、120 min，動(dòng)物意識(shí)喪失，角膜反射消失，眼球變白，瞳孔散大，為造模成功的標(biāo)志。所有動(dòng)物均入選實(shí)驗(yàn)。

1.3腦組織切片制備 各亞組取大鼠2只，10%水合氯醛(1 ml/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液經(jīng)心臟灌注固定，斷頭取腦，后固定2 h，依次脫水, 透明, 浸蠟, 包埋，于視交叉后連續(xù)冠狀切片(CM2027，Leica Germany)，片厚6 μm，貼于多聚賴氨酸處理的切片上，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4TUNEL凋亡細(xì)胞檢測(cè) TUNEL試劑盒由Clontech，USA提供。取上述切片，常規(guī)脫蠟入水，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，細(xì)胞核呈棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞，部分切片不加探針以0.1 mol/L PBS代替染色，不出現(xiàn)陽(yáng)性著色。高倍顯微鏡下(400倍，Olympus CK2，Japan)，每張切片隨機(jī)觀察海馬區(qū)4個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其均值。

1.5免疫組織化學(xué)染色 兔抗鼠CIDE-B抗體由Santa Cruz Co. Ltd.(USA)提供。取上述切片，按辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔試劑盒(Bio Vis，USA)說(shuō)明書(shū)操作，DAB顯色，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色者為CIDE-B陽(yáng)性細(xì)胞，部分切片不加一抗以0.1 mol/L PBS代替染色，不出現(xiàn)陽(yáng)性著色。高倍顯微鏡下(400倍，Olympus CK2，Japan)，每張切片隨機(jī)觀察海馬區(qū)4個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.6CIDE-B蛋白質(zhì)含量測(cè)定 各亞組取大鼠2只，10%水合氯醛(1 ml/kg)腹腔注射麻醉，PBS經(jīng)心臟灌注，斷頭取腦，分離海馬組織100 mg，按蛋白提取試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司)測(cè)定總蛋白含量，Western 印跡法測(cè)定CIDE-B蛋白含量。

1.7RNA提取與鑒定 各亞組取大鼠2只，10%水合氯醛(1 ml/kg)腹腔注射麻醉，磷酸鹽緩沖液經(jīng)心臟灌注，斷頭取腦，分離海馬組織100 mg，TRIZOL(Invitrogen)提取RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度。RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線投射儀(Lite，USA)觀察18 s和28 s的強(qiáng)度，確定RNA。

1.8RT-PCR 從GeneBank里查找CIDE-B和內(nèi)參β-actin的mRNA序列AF: 041377, GI:3114593，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)軟件引物設(shè)計(jì)合成，CIDE-B的上、下游引物：正義鏈5'GTGGGATGTTGTCATACGG 3'，反義鏈5'AGTCAGCTTGGTTACCTAGG 3'，目的片段長(zhǎng)度為438 bp。由上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。按提供PCR試劑盒(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)標(biāo)本的CIDE-B mRNA的表達(dá)。

1.9瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像及灰度分析 采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀拍攝凝膠圖像(MIG2000)，測(cè)定各目的基因條帶的吸光度值。校正數(shù)據(jù)并求出其與β-actin的比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。

2 結(jié) 果

2.1海馬神經(jīng)元凋亡 缺血30 min海馬區(qū)出現(xiàn)少量變性神經(jīng)元細(xì)胞，胞核固縮濃染，核膜核仁破碎邊集，胞膜皺縮，胞質(zhì)缺失；缺血90 min海馬神經(jīng)元變性較缺血30 min時(shí)嚴(yán)重，細(xì)胞體積縮小，邊集神經(jīng)元周緣深染，數(shù)量明顯增加；缺血120 min凋亡神經(jīng)元數(shù)量較缺血90 min時(shí)明顯減少。上述神經(jīng)元病理學(xué)改變主要發(fā)生在腦缺血再灌注7 d。與假手術(shù)組比較，缺血30、90、120 min再灌注6 h、1、3、7、14 d亞組凋亡細(xì)胞明顯增加(t=3.32，P<0.01；t=4.03，P<0.01；t=2.69，P<0.05)，其中再灌注7 d和14 d亞組凋亡呈高值表達(dá)，而再灌注28 d亞組呈低值表達(dá)(表1)。

2.2海馬區(qū)CIDE-B陽(yáng)性神經(jīng)元 與假手術(shù)組比較，缺血30、90、120 min再灌注6 h、1、3、7、14、28 d亞組CIDE-B陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增加(t=3.05，P<0.05；t=4.62，P<0.01；t=2.66，P<0.05)，其中再灌注7 d和14 d亞組陽(yáng)性神經(jīng)元最多，再灌注28 d亞組低值表達(dá)(表2)。

2.3CIDE-B mRNA表達(dá) RT-PCR檢測(cè)顯示：與假手術(shù)組比較，缺血30，90 min再灌注7 d, 14 d, 28 d時(shí)CIDE-B mRNA表達(dá)顯著增加，且明顯高于再灌注6 h, 1, 3 d亞組；缺血120 min明顯低于缺血30，90 min再灌注各時(shí)點(diǎn)。

2.4CIDE-B蛋白含量 Western 印跡法檢測(cè)顯示：與假手術(shù)組比較，缺血30, 90, 120 min再灌注7, 14 d亞組CIDE-B蛋白含量明顯增加，且高于再灌注6 h, 1, 3，28 d亞組(P<0.05)；其中缺血120 min再灌注28 d亞組明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)。

表1 腦缺血再灌注后海馬區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

表2 腦缺血再灌注后海馬區(qū)CIDE-B陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

3 討 論

細(xì)胞凋亡的特征是細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚〔11〕。一旦凋亡啟動(dòng)后細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)在嚴(yán)格的蛋白水解酶作用下有序逐漸銷毀，最終被周圍的細(xì)胞吞噬〔12〕。研究表明〔13〕，缺血2 h再灌注48 h組凋亡細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰，缺血2 h再灌注72 h組有所下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，神經(jīng)元凋亡在一定時(shí)限內(nèi)隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，說(shuō)明再灌注損傷是導(dǎo)致缺血區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的主要形式〔14〕。腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)凋亡啟動(dòng)后，CIDE-B mRNA已經(jīng)開(kāi)始活躍表達(dá)，其豐度增加是其功能蛋白翻譯表達(dá)增加的基礎(chǔ)。本結(jié)果提示CIDE-B基因活化和CIDE-B蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡存在內(nèi)在的聯(lián)系。缺血90 min時(shí)CIDE-B mRNA活化與凋亡時(shí)程表達(dá)呈時(shí)相依賴性。相應(yīng)階段性神經(jīng)元凋亡發(fā)生出現(xiàn)的時(shí)間及嚴(yán)重程度都與CIDE-B mRNA和蛋白的表達(dá)變化趨勢(shì)相一致。

4 參考文獻(xiàn)

1Lechardeur D,Drzymala L,Sharma M,etal. Determinants of the nuclear localization of the heterodimeric DNA fragmentation factor (ICAD/CAD)〔J〕.J Cell Biol,2000;150(2):321-34.

2Kazuhiro I. Activation of caspase-3,proteolytic cleavage of DFF and no oligonuleosomal DNA fragmentation in apoptosis〔J〕.J Biochem,2002;131(3):469-75.

3Inohara N,Koseki T,Chen S,etal.CIDE a novel family of cell death activators with homology to the 45 kD subunit of the DNA fragmentation factor〔J〕.J EMBO,1998;17(6):2526-33.

4Liang L,Zhao MJ,Xu ZH,etal. Molecular cloning and characterization of CIDE-3,a novel member of the cell-death-inducing DNA-fragmentation-factor (DFF45)-like effector family〔J〕. Biochem J,2003;370(2):195-203.

5Pei Z,Lugovskoy AA,Mc Carty JS,etal. Solution structure of DFF40 and DFF45 N-terminal domain complex and mutual chaperone activity of DFF40 and DFF45〔J〕.Proc Natl Acad Sci,2001;98(9): 6051-5.

6Sakahira H,Iwamatsui A,Nagata S. Specific chaperone-like activity of Inhibitor of caspase-activated DNase for caspase-activated DNase〔J〕.J Biol Chem,2000;275(11): 8091-6.

7Inohara N,Koseki T,Chen S,etal. Identification of regulatory and catalytic domains in the apoptosis nuclease DFF40/CAD〔J〕.J Biol Chem,1999;274(1):270-4.

8Chen ZG,Guo K,Toh SY,etal. Mitochondria localization and dimerization are required for CIDE-B to induce apoptosis〔J〕.J Biol Chem,2000;275(10):22619-22.

9Sun HZ，Wang ZG，Zhu PF. Relationship between CIDE-B change and neuronal under various injuring conditions〔J〕.Chi J Trauma,2006;22(7):535-8.

10Pulsinelli WA，Buehan AM.The four vessel occlusion rat model；method for complete occlusion cerebral arteries and control of collateral circulation〔J〕.Stroke,1998;19(7):913.

11Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR,etal. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics〔J〕.Br J Cancer,1972;26(2):239-57.

12Dini L,Ruzittu MT,Falasca L. Recognition and phagocytosis of apoptotic cells〔J〕. Scanning Microsc,1996;10(1):239-51.

13Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis〔J〕.Nature,2000;407(6805):770-6.

14Wang YP,Yang JS,Shi XQ,etal. Relationship between expression of apoptosis inducing factor and neuronal apoptosis in rats withfocal cerebral ischemia〔J〕.Chi J Neuromed,2010;9(6): 582-5.