辛伐他汀對膿毒癥大鼠血清腫瘤壞死因子α及一氧化氮表達的影響

俞國峰 鄭 霞 方 強

(浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科,浙江 杭州 310003)

目前認為，多種炎癥因子在膿毒癥的形成和發(fā)展過程中起著十分重要的作用，如腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細胞介素(IL)-1，-6，-8等〔1〕。炎癥因子的過量生成可激活巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞，使其表達誘導型一氧化氮合酶(NOS),產(chǎn)生和釋放大量一氧化氮(NO)，而NO和細胞因子參與了膿毒癥時低血壓和組織細胞結(jié)構(gòu)功能損傷的發(fā)生發(fā)展過程。臨床研究顯示，他汀類藥物不但有降脂作用，還可以抑制炎性因子的釋放，抑制炎性細胞的黏附，降低膿毒血癥的發(fā)生率和病死率〔2〕。本實驗旨在探討辛伐他汀對膿毒癥大鼠的作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物藥品和試劑 健康成年雄性SD大鼠96只,體重280～320 g,由浙江大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。辛伐他汀片，20 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司。TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。NO試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供。

1.2實驗分組、給藥方法及模型建立 96只雄性SD大鼠按照隨機排列表法分為:正常對照組、盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)組、辛伐他汀組,各32只。正常對照組用淀粉20 mg·kg-1·d-1加入2 ml生理鹽水制成混懸液灌胃5 d，術(shù)前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，無菌條件下取下腹正中切口2 cm，翻動盲腸后還納腹腔，逐層縫合切口，置籠內(nèi)活動，不禁飲食。CLP組術(shù)前灌胃與正常對照組相同，采用CLP手術(shù)制作膿毒癥大鼠模型〔3〕。辛伐他汀組用研缽粉碎辛伐他汀，以20 mg·kg-1·d-1加入2 ml生理鹽水制成混懸液連續(xù)灌胃5 d，并采用CLP手術(shù)制作膿毒癥大鼠模型。

1.3標本收集及測定 各時間組大鼠分別在術(shù)后各自時間點從大鼠頸動脈采血，在采血管中靜置30 min，4℃以4 000 r/min離心15 min，分離出血漿后于-80℃冰箱中保存待測。并記錄術(shù)后5 d各組大鼠的生存情況。TNF-α用放免法測定,NO用硝酸還原酶法測定。

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠不同時間點血清TNF-α和NO水平比較 正常對照組在在各時間點的TNF-α及NO無顯著差異。三組在術(shù)后0 h的血清TNF-α及NO無顯著差異，CLP組術(shù)后6 h、12 h、24 h的血清TNF-α及NO顯著高于正常對照組(P<0.05)。辛伐他汀組在術(shù)后6 h、12 h、24 h的TNF-α、NO較正常對照組升高(P<0.05)，但同CLP組比較，均明顯降低(P<0.05)。CLP組和辛伐他汀組術(shù)后12 h TNF-α達高峰,NO水平在觀察時間段內(nèi)術(shù)后24 h為最高峰。見表1，表2。

表1 三組大鼠不同時間點血清TNF-α水平

表2 三組大鼠不同時間點血清NO水平

2.2三組大鼠術(shù)后存活率比較 術(shù)后5 d正常對照組大鼠均存活，存活率100%，CLP組大鼠存活4只，存活率12.50%，辛伐他汀組存活18只，存活率56.25%，辛伐他汀組存活率明顯高于CLP組(P<0.05)。

3 討 論

研究〔4，5〕顯示，他汀類藥物能通過“多效應”機制改善膿毒癥模型和患者的預后，其中最重要的就是抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生，從而減輕其所致的“炎癥瀑布”。目前認為TNF-α是內(nèi)毒素刺激后最先表達的細胞因子，它可進一步誘導自身和其他細胞因子的產(chǎn)生和釋放，直接抑制心肌和血管平滑肌，促進微血栓形成等，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔6～8〕。因此抑制膿毒癥是TNF-α的表達可能起到阻斷膿毒癥發(fā)展的作用。本研究結(jié)果表明，TNF-α參與了膿毒癥的病理生理過程。對于該因子各時相的變化，一方面可能與TNF-α的半衰期較短有關(guān)，另一方面可能與內(nèi)毒素的濃度有關(guān)。本實驗還說明辛伐他汀在膿毒癥時抑制了TNF-α的表達，證明辛伐他汀對膿毒癥的抗炎作用。辛伐他汀的主要作用是降脂，但目前認為它對心腦血管疾病的保護作用是源自它的非降脂作用，其中最主要的是其抗炎效應〔9〕。目前對于辛伐他汀對TNF-α的抑制作用機制尚不明確，認為可能與辛伐他汀對細胞信號傳導通路上對 G蛋白的鈍化，影響絲裂原激活的蛋白激酶，磷脂酰肌醇-3 激酶，細胞核因子-κB(NF-κB)系統(tǒng)的活性有關(guān)〔10〕。

膿毒癥時在大量炎癥因子在多種炎癥介質(zhì)刺激下，產(chǎn)生大量的NO，大量的NO 及其代謝產(chǎn)物超氧亞硝酸鹽具有細胞毒性作用,使血管平滑肌松弛、血管擴張，并導致心肌收縮力下降，血管壁通透性增加，大動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能受損，線粒體呼吸鏈電子傳遞受抑制等作用，最終導致多臟器功能衰竭。因此抑制膿毒癥時NO的過量生成，可以減少內(nèi)皮細胞損傷，預防多臟器功能衰竭的發(fā)生。本實驗研究說明在膿毒癥時血清NO濃度升高明顯。本研究還提示辛伐他汀能夠抑制膿毒癥大鼠血清NO水平。

目前他汀類藥物對膿毒癥時血清NO的可能調(diào)節(jié)機制主要通過：降低膿毒癥時誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達：研究證實它是通過TNF-α、IL-1β等刺激細胞,由細胞內(nèi)NF-κB系統(tǒng)和信號轉(zhuǎn)導因子通路調(diào)控合成的〔11〕。高和活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)水平：眾多的實驗研究證據(jù)提示他汀類藥物通過恢復磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3-K)膜轉(zhuǎn)位水平激活PI3-K〔12〕，活化的PI3-K使其下游的Akt磷酸化eNOS活化。另外，研究顯示他汀類藥物通過影響小窩蛋白功能增加eNOS合成〔13〕。因此,他汀類藥物能增加eNOS表達水平的同時抑制iNOS合成,恢復eNOS與iNOS的動態(tài)平衡,保持血清NO的正常水平，從而保護了內(nèi)皮的完整功能〔14〕，避免膿毒癥時NO的過度表達引起的內(nèi)皮功能損傷而導致一系列嚴重的病理生理變化。

本實驗大鼠術(shù)后5 d存率結(jié)果提示辛伐他汀組具有抗膿毒癥的作用,可以提高CLP膿毒癥大鼠的生存率。Merx等〔15〕采用CLP手術(shù)制膿毒癥大鼠模型，預先用他汀類藥物處理過的小鼠的平均存活率是CLP組的4倍。不僅動物實驗，Kruger 等〔16〕對438例患者中66例(占總?cè)巳旱?5%)入院前正在服用他汀類藥物，而且其中85%患者入院后仍繼續(xù)接受他汀類藥物治療進行的回顧性調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物治療對膿毒癥患者有益，他汀治療組與CLP組相比，28 d總病死率和由膿毒癥所致的病死率顯著下降。

本研究顯示膿毒癥時血清TNF-α和NO的水平升高，參與了膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過程，辛伐他汀能夠抑制膿毒癥大鼠血清TNF-α和NO的水平，從而阻斷其過量生成所介導的生物學效應，從而提高CLP膿毒癥大鼠的5 d生存率。但辛伐他汀是否也影響抗炎介質(zhì)的生成，膿毒癥的量效關(guān)系，不同給藥方式是否有影響，均有待進一步研究。

4 參考文獻

1Fraunberger P，Drexel H，Walli AK.Pathophysiology of sepsis and possible influence of statins〔J〕.Dtsch Med Wochenschr，2010；135(43):2128-32.

2Janda S，Young A，F(xiàn)itzgerald JM，etal.The effect of statins on mortality from severe infections and sepsis:a systematic review and meta-analysis〔J〕.J Crit Care，2010；25:656-22.

3劉福英，劉田福.實驗動物學〔M〕.北京:中國科學技術(shù)出版社，2005：209-10.

4Falagas ME，Makris GC，Matthaiou DK，etal.Statins for infection and sepsis:a systematic review of the clinical evidence〔J〕.Antimicrob Chemoth，2008；61(4):774-85.

5于 健，曲茂興，呂慧怡.他汀類調(diào)脂藥對膿毒癥患者的保護作用〔J〕.醫(yī)學與哲學，2010；31(6):44-5.

6Tetta C,Cavaillon JM,Camussi G,etal.Continuous plasma filtration with sorbents〔J〕.Kidney Int,1998;66(Suppl):186.

7Blaekwell TS，Christman JW.Sepsis and cytokine:current status〔J〕.Br J Anaesth，1996；77(1):110.

8Marsh CB，Wewers MD.The pathogenesis of sepsis:factors that modulate the response to gram-negative bacterial infection〔J〕.Clin Chest Med，1996；17(2):183.

9Liao JK.Beyond lipid lowering:the role of statins in vascular protection〔J〕.Int J Cardiol，2002;86:5-18.

10Isabelle DL，Jean CP.Statins in the critically ill〔J〕.Ann Int Care 2012；2:19.

11Wagner AH,Schwabe O,Hecker M.Atorvastatin inhibition of cytokine-inducible nitric oxide synthase expression in native endothelial cells in situ〔J〕.Br J Pharmacol,2002；136:143-9.

12Mastuda N,Hayashi Y,Takahashi Y,etal.Phosphorylation of endothelial nitric-oxide synthase is diminished in mesenteric ateries from septic rabbits depending on the altered phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway revesal effect of fluvastatin therapy〔J〕.Pharmacol Exp Ther,2006；319:1348-54.

13Laufs U,La Fata V,Plutzky J,etal.Upregulation of endothelial nitric oxide synthase by HMG CoA reductase inhibitors〔J〕.Circulation,1998；97:1129-35.

14Wayman NS,Ellis BL,Thiemermann C.Simvastatin reduces infarct size in a model of acute myocardial ischemia and reperfusion in the rat〔J〕.Med Sci Monit,2003；9(5):155-9.

15Merx MW,Liehn EA,Janssens U,etal.HMG-CoA reductase inhibitor simvastatin profoundly improves survival in a murine model of sepsis 〔J〕.Circulation,2004；109(21):2560-5.

16Kruger P，F(xiàn)itzsimmons K，Cook D，etal.Statin therapy associated with patients with bacteremia 〔J〕.Intensive Care Med，2006；32(1):75-9.