多聚肌苷酸聯(lián)合他汀對兔動脈粥樣硬化斑塊中膽固醇結晶及高敏C反應蛋白表達的影響

王 寧 孫榮國 李海霞 王 夢 呂以杰

(山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院心內科，山東 濟南 250013)

膽固醇從過度飽和的液體形態(tài)中結晶析出可能是導致動脈粥樣硬化斑塊破裂和侵蝕從而引發(fā)血栓形成的直接原因。 因而對膽固醇結晶的研究越來越受到重視。近年來研究發(fā)現(xiàn)〔1～3〕，在人類血管內皮細胞膜上有一種能夠攝取ox-LDL的新型受體-LOX-1。LOX-1在人類動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展以及其他病理生理過程中可能發(fā)揮著關鍵作用〔4〕。我們知道AS的病理生理過程是非常復雜的，炎癥學說在AS的發(fā)病機制中占有重要的地位。本實驗研究利用LOX-1阻斷劑多聚肌苷酸(polyⅠ)聯(lián)合他汀對兔AS模型進行干預,研究其對AS斑塊組織中膽固醇結晶和hs-CRP表達的影響。

1 資料與方法

1.1實驗動物 30只6周齡、質量1.5～2.0 kg的健康雄性新西蘭大白兔購于山東省農(nóng)業(yè)科學院，動物使用許可證號：SYXK(魯)20080005；動物生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)20090013。

1.2儀器及試劑 polyⅠ購于美國Sigma公司；膽固醇購于安徽天啟化工科技有限公司；氟伐他汀由北京諾華制藥有限公司提供；Elisa試劑盒購于R&D公司。

1.3動脈粥樣硬化動物模型的建立 30只雄性新西蘭大白兔隨機分為普通飼料喂養(yǎng)組(對照組n=6)；球囊拉傷后高脂飼料喂養(yǎng)組(高脂組n=6)；球囊拉傷后高脂飼料加肌肉注射組(polyⅠ組n=6)；球囊拉傷后高脂飼料加氟伐他汀喂養(yǎng)組(他汀組n=6)；球囊拉傷后高脂飼料加氟伐他汀及polyⅠ干預組(干預n=6)，各組動物均喂養(yǎng)12 w后，3%戊巴比妥鈉麻醉致死取其腹主動脈〔5〕。

1.4兔腹主動脈組織病理形態(tài)學檢查 解剖分離腹主動脈并除去外膜粘連的脂肪組織，常規(guī)固定、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片并HE染色，在光學顯微鏡下觀察各組腹主動脈標本的病理形態(tài)學改變并留取圖像。

1.5斑塊組織中的測定 分別取各組兔腹主動脈組織標本適量，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各組標本斑塊組織中高敏C反應蛋白(hs-CRP)的含量。試驗過程嚴格按照說明書操作。

2 結 果

2.1血管組織病理形態(tài)學改變 腹主動脈組織病理形態(tài)學：對照組動脈內皮細胞完整，緊貼內彈力板，中層平滑肌細胞排列整齊，胞質呈嗜酸性紅染，無明顯脂質沉淀，也無明顯膽固醇結晶；高脂組內膜內皮細胞脫落，可見粥樣斑塊形成；斑塊表面有較薄的纖維組織覆蓋(纖維帽)；纖維帽下含大量無定形的壞死崩解產(chǎn)物，其內含大量膽固醇結晶、泡沫細胞和少量淋巴細胞。中膜因斑塊壓迫，平滑肌細胞(SMC)萎縮，彈力纖維破壞而變薄，中層平滑肌排列紊亂，胞質嗜酸性的平滑肌細胞減少代之以大量胞質淡染、充滿脂質空泡的泡沫細胞，部分斑塊底部和邊緣出現(xiàn)肉芽組織/有新生血管，并伴有淋巴細胞/炎細胞浸潤。他汀組病變較高脂組明顯減輕，內膜內皮細胞部分脫落，可見纖維斑塊形成，表現(xiàn)為內膜下散在不規(guī)則隆起的斑塊，斑塊表面為大量SMC和細胞外基質所組成的較厚的纖維帽，纖維帽下可見數(shù)量不等的泡沫細胞、SMC、細胞外基質成分和少量膽固醇結晶。polyⅠ組內皮細胞部分脫落，斑塊表面有纖維組織覆蓋，內膜纖維帽下含泡沫細胞，伴少量炎細胞浸潤，可見膽固醇結晶但比高脂組少。聯(lián)合組病變較高脂組明顯減輕，內膜稍增厚，可見少量泡沫細胞，內彈力板完整。中膜平滑肌排列整齊，未見明顯膽固醇結晶。見圖1。

圖1 各組兔腹主動脈組織病理學變化(HE，×100)

2.2兔血管斑塊組織中hs-CRP的表達 與高脂組(22.900±3.830)相比polyⅠ組中hs-CRP表達量(16.965±1.866)明顯減少(P=0.000)；他汀組(12.439±2.359)較polyⅠ組hs-CRP表達量更少(P<0.05)；聯(lián)合組hs-CRP表達(11.507±1.908)量較高脂組減少最明顯(P=0.000)，對照組為9.496±0.927。

3 討 論

hs-CRP不僅與AS發(fā)生有關，而且與其進展有關，hs-CRP可增加內皮黏附分子和單核細胞誘導蛋白-1的表達，促進巨噬細胞吸收LDL-1，促進單核細胞活化和通過誘導單核細胞和組織因子的促凝作用，hs-CRP和具有表淺泡沫細胞、大的壞死核心、薄的纖維帽的易損動脈粥樣硬化有關，說明hs-CRP不僅是全身的炎癥標志物，而且直接參與了AS的形成和AS斑塊的破裂〔6〕。

近年研究已證實，AS早期病變中即存在微小膽固醇結晶，而且與早期炎癥有關，因此膽固醇結晶不僅是AS病變的標志，而且還可能是AS的促進因子。體外研究發(fā)現(xiàn)，他汀能抑制膽固醇結晶的形成和體積增長，并呈劑量依賴性；能抑制結晶形成，同時破壞和溶解結晶結構；還能防止膽固醇結晶刺破纖維膜。對人體斑塊內膽固醇作用的研究發(fā)現(xiàn)，他汀治療使膽固醇結晶數(shù)量顯著減少〔7〕。

LDL經(jīng)氧化修飾后主要通過LOX-1介導血管內皮損傷，導致血管內皮細胞功能障礙、泡沫細胞形成及凋亡、炎性介質hs-CRP及基質金屬蛋白酶分泌,在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用〔8〕。新近的研究證實LOX-1特異性的抗體或其拮抗劑多聚肌苷酸有拮抗LOX-1 的作用，阻止ox-LDL 誘導的血管損傷〔9～12〕,他汀類藥物的抗AS及非調脂抗炎作用已被大量研究所證實。

本實驗說明：①LOX-1的阻斷劑polyⅠ具有一定的抗炎作用，可以抑制斑塊組織中hs-CRP的表達，在一定程度上阻止斑塊的形成。②polyⅠ和他汀聯(lián)合抗炎效果是增強的。因大量研究證實ox-LDL是LOX-1在體內的主要配體，LOX-1主要表達于血管內皮細胞表面，對ox-LDL 起到結合、吞噬和降解的作用〔13〕，推斷polyⅠ可能通過阻斷ox-LDL與LOX-1的結合從而發(fā)揮抑制AS發(fā)生發(fā)展的作用。氟伐他汀可通過減少ox-LDL的表達而下調細胞Lox-1的表達，從而降炎癥介質的分泌，減少斑塊中炎癥反應和基質成分的降解〔14〕。

比較本實驗研究各組標本組織病理學圖片可以看出，高脂組動脈粥樣硬化最嚴重，斑塊內含有大量膽固醇結晶；polyI組較高脂組的膽固醇結晶少；氟伐他汀組較polyⅠ組的抗AS作用稍強，膽固醇結晶少；聯(lián)合組抗AS效應最明顯，未見明顯膽固醇結晶。說明：①polyⅠ可減少斑塊中膽固醇結晶的形成，從而抗AS，避免膽固醇結晶的析出 造成各器官的栓塞。②polyⅠ和他汀聯(lián)合更能明顯抑制膽固醇結晶的形成 。早期干預膽固醇結晶的形成或許會成為今后穩(wěn)定斑塊及抗動脈粥樣硬化治療的熱點。

4 參考文獻

1Ridker PM，Rifai N，Rose L,etal.Comparison of C-reactive protein and low density lipoprotein cholesterol levels in the prediction of first cardiovascular events〔J〕.N Engl J Med，2002；347(20):1557-65.

2Braunwald E.Cardiovascular medicine at the turn of the millennium：triumphs，concerns，and opportunities〔J〕.N Engl J Med,1997；337(19):1360-9.

3Yeh ET，Palusinski RP.C-reactive protein：the pawn has been promoted to queen〔J〕.Curr Atheroscler Rep，2003；5(2)：101-5.

4Murase T，Kume N，Kataoka H，etal.Identification of soluble forms of lecfin- like oxidized LDL receptor-1〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000；20(3)：715-20.

5陳文強，張 運，季曉平，等.球囊拉傷致家兔動脈粥樣硬化斑塊破裂及血栓形成〔J〕.中國動脈硬化雜志，2004；12(2):151-4.

6湯 涌，黃 進，陸治平，等.冠心病患者血清超敏C反應蛋白、高密度脂蛋白膽固醇狀況分析〔J〕.實用全科醫(yī)學，2006；4(4)：386-7.

7Abela GS,Vedre A,Janoudi A,etal.Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization〔J〕.Am J Cardiol，2011;107(12)：1710-7.

8Mehta JL,Chen J，Hermonat PL,etal.Lectin-like oxidizelow-density lipoprotein receptor-1(LOX-1)：acritical player in the development of atherosclerosis and related disorders〔J〕.Cardiovasc Res，2006；69(1):36-45.

9朱惠蓮，夏 敏，侯孟君，等.氧化修飾低密度脂蛋白通過血凝素樣氧化修飾低密度脂蛋白受體1誘導內皮細胞黏附分子的表達〔J〕.中華心血管病雜志，2005；33(8)：743-7.

10王 夢，呂以杰.血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1對THP-1單核巨噬細胞源泡沫細胞MMP-9表達的影響及辛伐他汀的干預作用〔J〕.山東大學學報：醫(yī)學版 ，2008；46(12):1136-40.

11孫榮國，徐龍進，胡鴻雁，等.多聚肌苷酸在兔動物模型中抗動脈粥樣硬化的作用及對血管組織LOX-1表達的影響〔J〕.山東大學學報：醫(yī)學版，2011；49(7)：78-82.

12Ishino S,Mukai T，Kume N，etal.Lectin-like oxidized LDLreceptor-1 (LOX-1) expression is associated with atherosclerotic plaque instability analysis in hypercholesterolemic rabbits〔J〕.Atherosclerosis,2007；195(1)：48-56.

13Sawamura T， Kume N， Aoyama T，etal.An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein〔J〕. Nature，1997；386(6620)：73-7.

14Hofnagel O,Luechtenborg B，Eschert H,etal.Pravastatin inhibits expression of Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) in watanabe heritable hyperlipidemic rabbits：a new pleiotropic effect of statins〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006；26(3):604-10.