他克莫司在大鼠心肌梗死后心力衰竭中的作用

白輝英 馮 星 孫 明 王曉蘭

(吉林市人民醫院心血管內科，吉林 吉林 132001)

持續血流動力學異常造成心臟長期負荷過重可導致心室重塑。心肌重塑是一個多因素相互作用的連續過程，鈣調神經磷酸酶(CaN)介導的信號通路在心室重塑中起重要作用〔1〕，抑制CaN活性可阻斷與心室重塑有關的細胞和分子事件。本實驗研究他克莫司(FK506)在心肌梗死后心力衰竭形成過程中的作用，尋找心肌梗死后心力衰竭藥物治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1實驗動物 兩月齡雄性SD大鼠，體重(300±30)g，由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供。

1.2急性心肌梗死(AMI)模型建立 SD大鼠經20%烏拉坦5 ml/kg腹腔內注射麻醉后，背位固定于手術臺上，無菌操作下沿大鼠左腋下與胸骨劍突連線處切開皮膚，逐層鈍性分離肌肉，將面罩罩住大鼠口鼻連接人工呼吸機(參數設定為：呼吸比1∶2，潮氣量8～12 ml，呼吸頻率75～80，壓力1.5～2.5 kPa)，沿4、5肋間開胸，分離心包膜，擠出心臟至可見肺動脈圓錐，以0號線于左心耳根部下方2 mm處進針，在肺動脈圓錐旁出針，深度為0.3～0.5 mm結扎LAD，心臟復位后迅速擠出空氣關閉胸腔，制造胸腔負壓狀態，縫合肌肉皮膚。假手術對照組在相同條件下穿過針線后不結扎。術后測定Ⅱ導聯心電圖，以心電圖作為大鼠AMI納入標準，若術后心電圖ST段抬高較術前未超過0.2 mV且QRS波群無明顯變化，則為造模型失敗。

1.3實驗分組 術后24 h存活，且模型成功的大鼠采用隨機方法分為control組、control+FK506組、假手術組(sham組)、模型組(model組)、model+FK506組，每組10只。

1.4給藥 FK506由安斯泰來制藥(中國)有限公司提供，批號1D5520A，用生理鹽水配置。篩選AMI模型后，將模型成功大鼠按0.3 mg/kg、5 ml/kg體積灌胃，1次/d，連續30 d。control組和sham組每日按5 ml/kg體積灌生理鹽水。

1.5心臟超聲檢查 給藥4 w后大鼠用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔內注射麻醉后，用彩色多普勒超聲診斷儀(APOGEE3500)，采用15L8w探頭，探頭頻率為14 MHz。左室短軸圖像在乳頭肌水平獲得，左室長軸圖像通過垂直于短軸獲得，舒張末期定義為左室容積最大時，收縮末期定義為左室容積最小時，測量左室長軸和左室短軸乳頭肌水平M型曲線，SWEEP 100～200 mm/s，共測5個心動周期。測量左室內徑、左室容量、左心功能、左心重量、左房內徑、室間隔和左室后壁收縮期與舒張期厚度及收縮期增厚百分比等指標。在胸骨旁左室短軸乳頭肌水平，用DTI-PW測定的左室前壁與左室后壁心肌運動頻譜，記錄主波Sm、Em、Am的峰值速度。

1.6大鼠心肌梗死重量指數 4 w后取心臟，生理鹽水沖洗去血污，剔除血管、脂肪等非心肌組織，用濾紙吸出水分，沿冠狀溝切除心房和右心室，留下左心室。順房室溝從心尖到心室底部平行將左心室切成0.1 cm厚的心肌片。切片后將左心室放在0.2%NBT溶液中37℃水浴環境染色5 min，梗死區域呈現未染色的灰白色，未梗死區域呈現NBT與脫氫酶反應后的藍色，切下灰白色區域稱重即為梗死心肌重量，稱取非梗死心肌重量，用梗死心肌重量/左心室重量，即為梗死重量指數。

2 結 果

2.1大鼠生存情況 術后model組死亡3只，model+FK506組死亡1只，余納入實驗大鼠均存。

2.2心肌梗死面積改變情況 術后4 w model組與sham組比較，心臟指數差異顯著(P<0.05)；model組與給藥組比較，心臟指數差異顯著(P<0.05)。見圖1，圖2。

圖1 心肌梗死面積

與sham組比較：1)P<0.05；與model組比較：2)P<0.05

2.3心臟超聲改變情況 model組與sham組比較，左心室前壁運動減弱，左心室射血分數明顯減弱(P<0.05)；術后4 w心臟超聲檢查可見給藥組可降低左心室前壁運動減弱及左心室射血分數減弱趨勢(P<0.05)。見表1。

表1 術后4 w大鼠心臟功能比較

3 討 論

心肌梗死動物模型的制作方法有多種，早期國外多采用Johns法，即在自主呼吸條件下，不用呼吸機支持，迅速開胸擠出心臟行冠狀動脈結扎。這種方法需要在極短時間內完成，技術要求高，難度大，且由于心臟移位，容易導致血流動力學紊亂和心律失常等并發癥，開胸后大鼠呼吸無法保證，因而手術死亡率極高。此后，Fisbein等在Johns法基礎上加以改進，應用小動物呼吸機維持呼吸，明顯提高了手術的成活率〔2〕。

本實驗方法操作簡便，可在開胸后為冠狀動脈結扎贏得更多時間，術后呼吸道并發癥少。而且本實驗以眼科開瞼器充分撐開肋間肌切口，不但手術視野清晰，而且避免心臟移位和血流動力學紊亂，明顯減少心肌損傷和心律失常的發生。

本研究采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支的方法構建心力衰竭模型，其優點在于有一定的臨床發病擬似性，可較好地模擬心肌缺血性心力衰竭。本研究中，心肌梗死造成心肌細胞嚴重缺血，營養及能量代謝障礙，心肌收縮力下降，心排血量明顯減少，進而加重總心臟負荷，導致惡性循環，發展為心力衰竭。造模4 w后，大鼠心臟左室前壁可見瘢痕組織，超聲心動圖示梗死區心肌運動減弱，射血分數減低。血流動力學檢查示收縮和舒張功能下降。提示急性心肌梗死動物模型建立成功，實驗中心肌梗死面積在35%～45%，表明實驗均一性良好。

正常情況下，肌質網的Ca2+轉運在調節心肌收縮和舒張中發揮重要作用。本實驗研究表明，FK506可降低大鼠心肌梗死后心力衰竭心肌的減弱趨勢，對衰竭心肌的左室功能有改善作用。FK506是CaN抑制劑，CaN是一種鈣離子敏感的蛋白磷酸酶，可被細胞內持續升高的Ca2+濃度激活，使磷酸化的蛋白去磷酸化〔3，4〕。所以，當心力衰竭發生時，衰竭心肌收縮力下降，與肌漿網上鈣離子釋放量明顯下降有關。給予CaN抑制劑FK506，FK506與CaN底物結合，阻止了舒張期鈣的滲漏，抑制了心力衰竭的進展〔5〕。

本實驗結果表明FK506可降低大鼠心肌梗死后心力衰竭心肌的減弱趨勢，對衰竭心肌的左室功能有改善作用。梗死后心力衰竭過程中發生心肌重塑與CaN通路有關。

4 參考文獻

1Ito H.No-reflow phenomenon and prognosis in patients with acute myocardial infarction〔J〕.Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2006；3：499-506.

2高 琴，關瑞錦.充血性心力衰竭大鼠模型的制作及意義〔J〕.心血管康復醫學雜志，2004；13(1)：27-30.

3Prestle J，Janssen PM，Janssen AP，etal.Over expression of FK506-binding protein FKBP12.6 in cardiomyocytes reduces ryanodine receptor mediated 〔J〕.Circ Res，2007;100(3):296-8.

4Nagata K，Somuta F，Obata K，etal.AT1 receptor blochade reduces cardiac calcineurin activity in hypertensive rats〔J〕.Hypertension，2002;40(2)：168.

5Hasenfuss G.Pieske B.Calcium cycling in congestive heart failure〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2002;34：951-69.