貝那普利對糖尿病大鼠腎臟結締組織生長因子表達的影響

姜 晶 王彩芹 劉楠楠

(北華大學附屬醫院病理科，吉林 吉林 132011)

結締組織生長因子(CTGF)是近年來發現的一種新的生長因子，具有介導細胞黏附、刺激細胞遷移 、 促進血管形成等作用，但是其最重要的功能為刺激成纖維細胞增殖和膠原沉積，促進肉芽組織形成及促纖維化等。目前研究表明CTGF異常表達在糖尿病腎病(DN)纖維化過程中起著至關重要的作用〔1〕。糖尿病引起腎小球硬化是DN產生的主要機制，目前認為CTGF是腎小球硬化過程中重要的生長因子〔2〕。本實驗觀察貝那普利對實驗性糖尿病大鼠腎臟CTGF表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組 Wistar大鼠34只，雌雄不限，體重197～255 g，由吉林省藥品檢驗所實驗動物科提供，血糖正常。隨機分為正常對照組(n=10)、糖尿病模型組(n=12)、貝那普利組(n=12)。實驗期間室溫控制在18～20℃，相對濕度50%，12 h交替照明，大鼠自由進食、飲水，保持墊料干燥。

1.2動物模型的建立及給藥 將鏈脲佐菌素(STZ)溶于0.01 mmol/L檸檬酸緩沖液中，模型組及貝那普利組大鼠腹腔注射65 mg/kg STZ緩沖液，對照組動物只注射等量檸檬酸緩沖液。72 h后尾尖靜脈采血測定空腹血糖，當血糖≥16.7 mmol/L，尿糖>，動物出現多飲、多食與多尿等臨床表現確定為糖尿病大鼠。次日貝那普利組給予貝那普利按10 mg·kg-1·d-1灌胃，每日一次，連續灌服12 w。對照組和模型組給等量自來水灌胃。實驗期間，大鼠自由進食、飲水，不給胰島素等降糖藥物進行治療。

1.3主要試劑和藥品 鏈脲佐菌素(STZ)為美國Sigma公司產品，貝那普利由北京諾華公司制造，血糖高靈敏度試劑盒(長春匯力生物工程技術有限公司)，尿葡萄糖檢測試紙片(桂林中輝生物技術有限公司)，尿白蛋白酶免疫法試劑盒(上海德波生物技術有限公司)。SP試劑盒及胃蛋白酶(福州邁新生物技術有限公司)，羊抗人CTGF-C末端抗體(1：100，R&D公司)。

1.4標本收集及處理 實驗結束前1 w(第11周末)，將大鼠放入代謝籠，禁食，收集并記錄24 h尿量，離心，-80℃冰箱保存。于實驗第12周末，在麻醉下眶后采血，處死大鼠后，迅速取雙側腎臟，清洗吸干后稱重，經腎門冠狀面取組織，置于10%甲醛液中固定。用日立7150型自動生化分析儀測定血和尿的各項生化指標。

1.5免疫組化檢查 將10%甲醛液固定的腎組織塊制成厚4 μm的切片，常規脫蠟、水化。按SP法試劑盒操作步驟進行，一抗為抗鼠CTGF-C末端抗體(1：100)，經胃蛋白酶室溫下消化20 min后，與一抗工作液37℃下孵育1 h，形成的復合物與3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)反應，顯色，顯微鏡下監視，呈紅色陽性為止，蘇術素復染、脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作陰性對照。使用IPP6.0圖像分析軟件進行免疫組織化學半定量分析：光鏡下高倍視野觀察每個標本，在腎皮質區隨機選取20個視野，陽性染色的部位及深淺以平均光密度值表示。

1.6統計學方法 應用SPSS11.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1各組動物血糖、體重、腎重及腎重/體重變化 腹腔注射STZ后，大鼠血糖逐漸升高，而體重減輕，說明糖尿病模型建立成功。糖尿病模型組有4只死亡，貝那普利組有3只死亡。12 w末時貝那普利組大鼠與糖尿病模型組比較空腹血糖降低不顯著、腎重輕微降低(P>0.05)，體重上升顯著，腎重/體重明顯下降(P<0.01)，見表1。

2.2各組大鼠尿素氮、血肌酐、尿白蛋白排泄率變化 12 w末時模型組大鼠尿素氮、血肌酐及尿白蛋白排泄率(UAER)升高，與對照組有顯著差異(P<0.01)；與模型組比較，貝那普利組上述各項指標均顯著下降(P<0.01)。見表2。

表1 各組空腹血糖、體重、腎重、腎重/體重結果

表2 各組尿素氮、血肌酐、UAER、尿總蛋白測定結果

2.3各組CTGF的表達情況 免疫組織化學染色顯示，CTGF陽性染色主要分布在腎小球上皮細胞、系膜細胞及系膜區和腎小管基膜。對照組腎小球、腎小管僅呈微弱表達，染色淺淡。而模型組CTGF表達呈強陽性。見圖1。半定量分析結果表明，模型組腎CTGF陽性染色百分比(66.4%±12.51%)顯著高于對照組(23.1%±3.55%)(P<0.05)；而貝那普利組(31.6%±8.93%)顯著低于模型組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠CTGF表達的免疫組織化學染色結果(×200)

3 討 論

CTGF對組織促纖維化效應明顯，可促進間充質細胞如成纖維細胞增殖及細胞外基質合成增加〔3〕。而腎小球肥大是DN早期比較特征性的改變，CTGF參與了DN發生發展多個環節〔4，5〕。在大鼠和人腎纖維化中，CTGF可能介導轉化生長因子(TGF-β)致病效應〔6，7〕。但轉化生長因子(TGF)-β作用廣泛，除誘導細胞增殖和促進組織纖維化外，還有抗炎和抗細胞分化等功能〔8〕，因此長期阻斷TGF-β，可能產生不良后果。但CTGF的作用相對單一，可能僅介導TGF-β的部分生物學效應，如刺激細胞增殖和細胞外基質合成，在促進組織器官纖維化方面發揮重要作用，并不參與TGF-β抗炎等生物學作用〔9〕。因此，CTGF可能是更特異的DN所引起腎纖維化的治療靶點，并已成為這一研究領域中新的熱點。CTGF在腎臟表達尤為豐富，其過度表達，可促進腎臟細胞外基質累積、腎小球硬化及腎小管間質纖維化，在DN腎臟肥大和纖維化中起重要作用〔10〕。本實驗結果提示貝那普利對DN大鼠腎臟具有良好的抗纖維化作用。總之，在高血糖刺激下，多種腎組織細胞如腎小球上皮細胞、系膜細胞和腎小管基膜異常分泌CTGF，促進細胞增生和細胞外基質積聚，從而參與DN性腎小球硬化的發生、發展。與此相反，CTGF在正常生理狀態下表達水平較低，生物效應較單一，阻斷CTGF表達或抑制其活性，可能是一種更特異、更有效地防治DN性腎小球硬化癥的手段。貝那普利能有效抑制CTGF的表達，但通過何種信號轉導通路來發揮生物學效應，有待深入探討。

4 參考文獻

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10李小彥，武文明，栗俊杰，等.氯沙坦對糖尿病大鼠腎臟的保護作用〔J〕.藥學服務與研究，2008；8(3)：204-8.