DAPT通過抑制NOTCH信號通路對食管癌細胞株體外增殖的影響

許雙塔 許建華 鄭正榮 趙清泉

(福建醫科大學附屬第二醫院腫瘤科，福建 泉州 362000)

食管癌的發展一般經過上皮不典型增生、原位癌、浸潤癌等階段，與其他惡性腫瘤一樣，強調早期診斷和早期治療〔1〕。Notch信號是相鄰細胞之間通訊進而調控細胞發育的重要通路，γ-分泌酶是由4個亞單位組成的膜內蛋白水解酶，主要參與β-淀粉樣蛋白前體(APP)和Notch等重要跨膜蛋白的切割和水解過程，γ-分泌酶滅活后，會影響Notch信號通路〔2〕。γ-分泌酶抑制劑(DAPT)(GSI-IX)是間接抑制γ-分泌酶底物Notch的活性，進而影響細胞信號傳導和細胞分化〔3〕。本研究通過觀察DAPT抑制NOTCH信號通路對食管癌細胞株HE-1體外增殖的影響，為其臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞株與主要試劑 DAPT、二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，胎牛血清(美國 GIBCO公司)，RPMI 1640培養基(美國Solarboi公司)，噻唑藍(MTT)粉、焦碳酸二乙酸(DEPC)(美國Amresco公司)，流式細胞儀(英國Stat公司，FACSCalibur型)，全自動酶標儀Fax-2100 (英國Stat公司),RT-PCR試劑盒和Trizol試劑(美國Invitrogen公司)。HE-1細胞由中國科學院上海細胞生物學研究所提供。

1.2研究方法 條件：10%胎牛血清，RPMI 1640培養基，37℃、5% CO2于恒溫孵育箱內培養，取對數生長期的HE-1細胞進行實驗。取對數生長期的HE-1細胞，用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化，加入適量RPMI1640并進行吹打，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入全培養基，調整濃度后接種于96孔板。隨機分為四組，繼續培養24 h，細胞貼壁后實驗組分別加入1、5、10 μmol/L的DAPT，對照組加入相應的培養液。

1.3MTT法檢測HE-1細胞體外增殖活性 每組設4個平行樣，繼續培養0、24、48、72 h后分別加入MTT 20 μl，去培養液，加入DMSO 150 μl并置于振蕩器上震蕩混勻，用酶標儀在570 nm波長下測定各孔吸光度值(D值)，抑制率=(實驗組D值-對照組D值/對照組D值)×100%，4個平行率取平均值作為最終抑制率。

1.4Western 印跡檢測Notch2/hes1表達情況 總蛋白抽提試劑盒提取4個組的細胞蛋白。首先去除培養基，加磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍，吸盡PBS盡量不留1滴，在冰上加入裂解液(0.1 ml/孔)，吹打使其與細胞完全接觸，12 000 r/min離心5 min，取上清液，-20℃貯存。預備沸水，將凍存的蛋白取出置入沸水煮5 min，配分離膠、濃縮膠，然后微量加樣器上樣，中間每孔加20 μl marker，余孔加上樣液，配電泳液預冷，電泳(先80 V蛋白跑至分離膠再120 V跑完)，然后配電轉液，起膠，裁下所需大小的膠置有電轉液的培養皿中，根據膠的大小裁下聚編氯丙烯(PVDF)膜及濾紙(右上角標記)，按濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序疊好，75 V電轉5 h，配一抗，4℃孵育24 h，濾紙吸干，TBS洗膜，二抗反應，Tris鹽酸緩沖液(TBS)洗膜，化學發光印證法(ECL)顯色，磷酸纖維素膜(NC)置于片夾中，曝光，顯影定影，圖像分析(采用Alpha軟件)。

2 結 果

2.1DAPT對食管癌HE-1細胞體外增值活性的影響 實驗組3個濃度梯度的細胞增殖活性均有不同，DAPT濃度越高，HE-1細胞體外增值活性越低，DAPT對其抑制率越高。從時間順序看，DAPT作用時間越長，HE-1細胞體外增殖活性越低，DAPT對其抑制率越高，高、中劑量組與低劑量組抑制率存在顯著差異(P<0.05)。見表1。

2.2NOTCH信號通路中Notch2/hes1表達情況 實驗組3個濃度梯度的細胞中NOTCH信號通路中Notch2/hes1表達不同，DAPT濃度越高，HE-1細胞NOTCH信號通路中Notch2/hes1表達水平越低，DAPT對其抑制率越高；從時間順序看，DAPT作用時間越長，食管癌HE-1細胞NOTCH信號通路中Notch2/hes1表達水平也越低(P<0.05)。見表3。

2.3HE-1中HER4的核表情況 隨DAPT濃度增高，實驗組3個濃度梯度的HE-1細胞中HER4表達水平呈順序降低，DAPT對其抑制率越高，從時間順序看，DAPT作用時間越長，HE-1細胞中HER4核外水平也越低(P<0.05)。見表2。

表1 DAPT對食管癌HE-1細胞體外增殖活性的影響〔n(%),n=4〕

表2 NOTCH信號通路中Notch2/hes1表達情況(n=4)

表3 食管癌細胞株HE-1中HER4的核表情況(n=4)

2.4DAPT濃度與HE-1細胞體外增殖活性的劑量效應關系 實驗組細胞增殖活性隨DAPT濃度的增高呈逐漸減低的趨勢，隨DAPT作用時間增長，HE-1細胞體外增值活性被抑制的越明顯(r48=834，r72=0.910，P<0.05)，見圖1。

2.5DAPT濃度與信號通路的活化程度關系 實驗組細胞中相關蛋白的表達灰度值隨DAPT濃度的增高呈逐漸減低的趨勢，DAPT作用時間越長灰度值減低越明顯(r24=-0.612，r48=-0.748，r72=-0.875，P<0.05)，見圖2。

圖2 DAPT濃度與信號通路的活化程度的關系

3 討 論

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)、CSL (CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱)DNA結合蛋白、其他的效應物和Notch的調節分子等組成〔4〕。Notch信號的產生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經過3次剪切，由胞內段(NICD)釋放入胞質，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合,形成NICD/CSL轉錄激活復合體，從而激活HES、HEY、HER等堿性-螺旋-環-螺旋轉錄抑制因子家族的靶基因，發揮生物學作用〔5〕。

前期研究表明食管癌細胞中，細胞核內有HER4表前期研究表明食管癌細胞中、細胞核內有HER4表達〔6〕。Notch信號是相鄰細胞之間通訊進而調控細胞發育的重要通路。γ-分泌酶是由4個亞單位組成的膜內蛋白水解酶，主要參與APP和Notch等重要跨膜蛋白的切割和水解過程〔7〕。研究發現〔8〕，小鼠皮膚γ-分泌酶滅活后，會影響Notch信號通路，從而引起與反常性痤瘡患者病變皮膚相似的組織病理改變。DAPT阻止了Notch信號通路的活化，通過抑制Notch2/hes1等相關細胞因子的表達對其發揮抑制作用，進而對細胞增殖產生影響。

食管癌系指由食管鱗狀上皮或腺上皮的異常增生所形成的惡性病變，Notch信號通路在腫瘤細胞之間起通訊作用，對腫瘤細胞的增殖有重要作用。本研究結果提示DAPT可能通過干擾γ-分泌酶，進而影響NOTCH信號通路中相關細胞因子的表達，進而通過抑制通路活性對細胞增殖活性起到抑制作用。

4 參考文獻

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