肉桂醛對RSV宿主細胞Bcl-2蛋白和Bax 蛋白表達的影響

代立娟 韓有文 李紹民 徐偉麗 李春媚 朱 有 馮 瀾

(佳木斯大學附屬第一醫院感染病科，黑龍江 佳木斯 154002)

呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒和小年齡兒童急性下呼吸道感染常見的病原，幾乎所有2歲以下的兒童都感染過RSV病毒〔1〕。近年來又發現RSV是感染老年人和免疫抑制成人的重要病毒。對RSV的預防目前仍然缺少有效的藥物和疫苗。肉桂醛是一種有機化合物，肉桂油的主要成分，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗突變等多種藥理作用，且毒副作用小。先期試驗已經證明肉桂醛有抗RSV的作用，但具體機制尚需要進一步試驗研究〔2〕。細胞凋亡是細胞更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。本研究通過細胞實驗探討肉桂醛抗RSV過程中對宿主細胞凋亡相關蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1材料 RSV株，Hela細胞株由佳木斯大學基礎醫學院病理生理教研室保存；肉桂醛購買于美國sigma公司、1640培養液(Invitrogen公司)，四季青牌胎牛血清；兔源Bcl-2蛋白多克隆抗體(美國Santa公司)、兔源Bax 蛋白多克隆抗體和FITI標記羊抗兔IgG抗體均購買于美國Santa公司。

1.2細胞培養 將Hela細胞接種在10%的細胞培養液的培養瓶中，放置于37℃、5%CO2培養箱中1～2 d更換細胞培養液，待細胞生長約80%以上時胰酶消化進行傳代，直至所需要細胞量。

1.3病毒收集接種病毒毒力測定 Hela細胞培養成70%后，接種RSV液，繼續培養當病變達到75%時經過三凍三融收集放低溫冰箱保存備用。

1.4肉桂醛配制 用2%細胞維持液將肉桂醛進行不同濃度稀釋再用濾器過濾備用。

1.5接種病毒毒力測定 將Hela細胞接種于96孔板待細胞長成單層，將已經稀釋好的不同濃度的病毒液每一個濃度重復8孔，并設陰性對照組和正常細胞組，置于培養箱中培養，顯微鏡觀察細胞形態，根據細胞變性效果(CPE)結果變化用Reed-Muench法計算CCID50。

1.6肉桂醛對Hela細胞毒性測定

1.6.1對RSV病毒的直接滅活作用 將Hela細胞接種至放有蓋玻片經多聚賴氨酸處理的6孔板中長成約70%備用，將低(0.078 1 mg/mg)、中(0.156 3 mg/mg)、高濃度(0.312 5 mg/mg)的肉桂醛與病毒液等量混勻，置37℃溫箱2 h。棄6孔板中培養液。每孔加入不同濃度混合液，設病毒對照，正常細胞對照，置37℃溫箱2 h，棄混合液病毒液，加入細胞維持液，觀察細胞變化，免疫熒光染色處理，激光共聚焦檢測。

1.6.2對RSV病毒的吸附作用 將Hela細胞接種至放有蓋玻片經多聚賴氨酸處理的6孔板中長成約70%備用，將低、中、高濃度的肉桂醛與病毒液等量混勻，棄六孔板中培養液。每孔加入低、中、高濃度肉桂醛與病毒混合液，設病毒對照，正常細胞對照，置37℃溫箱2 h，棄混合液病毒液，加入2%細胞維持液，觀察細胞變化，免疫熒光染色處理，共聚焦檢測。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0進行t檢驗。

2 結 果

2.1肉桂醛無毒濃度測定 在一定范圍內肉桂醛濃度降低使其對細胞毒性降低，細胞活力逐漸增強，試驗計算得出肉桂醛的有效無毒濃度范圍為0.156 3～0.312 5 mg/ml。

2.2RSV毒力 在病毒對照組細胞病變達到75%時，電鏡下50%細胞出現形態學變化時認為CPE陽性。用Reed-Muench法計算得CCID50為106.65，本實驗中100CCID50/100 μl病毒攻擊量為104.65。

2.3宿主Hela細胞Bcl-2蛋白熒光表達量的測定 激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示各組細胞內均可見不同強度的熒光，經藥物干預后和病毒感染組相比Bcl-2的表達量明顯增強，細胞存活率增加。見表1，圖1。

表1 各組細胞Bcl-2蛋白表達

2.4宿主Hela細胞Bax 蛋白熒光表達量的測定 激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示各組細胞內均可見不同強度的熒光，經藥物干預后和病毒感染組相比Bax的表達量明顯降低，細胞存活率增加。見表2，圖2。

表2 各組細胞Bax蛋白表達

正常組直接滅活

病毒組直接滅活

中濃度直接滅活

中濃度吸附

正常組直接滅活

病毒組直接滅活

中濃度直接滅活

中濃度吸附

3 討 論

RSV是一種嚴格細胞內寄生的微生物。感染病毒的細胞凋亡，對于病毒的大量復制無益。從這種病毒和細胞之間的相互作用關系來看，細胞凋亡是機體主動防御應對病毒感染的一種方式。RSV感染細胞后，源于內在的蛋白產物直接作用于細胞，與凋亡有關的因子及蛋白水解酶誘導發生凋亡。宿主細胞受到病毒攻擊后，發生凋亡可能是機體針對外來病毒侵入采取的保護機制之一。一些病毒感染性疾病的發展與細胞凋亡規律失常有關，參與疾病的發生發展過程。

細胞凋亡是細胞為維持自身內環境平衡，細胞自發的保護性死亡過程。已證實的主要凋亡調控基因分為兩大類，即凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促進基因Bax。這兩大類基因相互作用的結果共同決定細胞的生存與死亡走向〔3〕。Bcl-2 基因蛋白家族在細胞凋亡的調控中發揮著重要作用〔4〕，被認為是細胞凋亡調控的最后通路之一。其主要分布于核膜、線粒體膜和內質網膜等部位。Bcl-2 蛋白可通過拮抗野生型 P53 蛋白的促凋亡作用，抑制多種因素誘發的細胞凋亡。Bax 作為 Bcl-2 的同源體，抑制 Bcl-2 作用，其與 Bcl-2 基因一樣在組織廣泛表達〔5〕。

Bax 過量時誘導細胞凋亡，Bcl-2 過量時抑制細胞凋亡。已完成的實驗已經證實肉桂醛具有抗RSV作用〔6〕。細胞受病毒感染后的命運轉歸涉及許多生理和病理過程。最終是什么機制在這個高度復雜、精確控制的過程起核心作用，從以上實驗可以看出，Bcl-2和Bax之間的動態平衡，可能是決定細胞生死的核心機制之一。相信隨著深入研究Bcl-2/Bax的比率，將在疾病的診斷和治療中發揮越來越重要的作用。

4 參考文獻

1Harker JA，Yamaguchi Y，Culley FJ，etal.Delayed sequelae of neonatal RSV infection are dependent on cells of the innate immune system〔J〕.J Virol,2014;88(1):604-11.

2Theurer M，Shaik N，Lang F.Stimulation of suicidal erythrocyte death by transcinnamaldehyde〔J〕.Phytomedicine,2013；20(12)：1119-23.

3Tailor D，Hahm ER，Kale RK，etal.Sodium butyrate induces DRP1-mediated mitochondrial fusion and apoptosis in human colorectal cancer cells〔J〕.Mitochondrion,2013;s1567-7249(13)00255-9.

4Zhu M，Hong D，Bao Y，etal.Oridonin induces the apoptosis of metastatic hepatocellular carcinoma cells via a mitochondrial pathway〔J〕.Oncol Lett,2013；6(5)：1502-6.

5Zaman F，Chrysis D，Huntjens K，etal.Dexamethasone differentially regulates Bcl-2 family proteins in human proliferative chondrocytes：role of pro-apoptotic Bid〔J〕.Toxicol Lett,2014;224(2):196-200.

6代立娟，王 琳，馮 瀾.肉桂醛抗呼吸道合胞病毒的作用〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(6):1309-12.