激活 SHH 通路對急性腦缺血大鼠SYN、GAP-43的影響

劉花艷 婁季宇 曾志磊 陳苗苗 牛廣義

(鄭州大學第二附屬醫院神經內科,河南 鄭州 450014)

腦缺血后神經可塑性尤其是突觸再生近年來成為研究的熱點，突觸再生可能是促進神經功能恢復最重要的步驟。Keifer等〔1〕在海馬中研究發現突觸再生是潛在學習和記憶的主要機制，對于神經元損傷后的恢復有重要意義。Sonic Hedgehog(SHH)信號是胚胎發育、組織再生的重要調節器，通過調節細胞增殖、分化和軸突導向參與胚胎發育和出生后的修復，與突觸再生有著密切的聯系〔2〕。SHH對血管神經單元具有內源性抗炎作用，它的異常可以直接導致突觸再生障礙，最終不利于神經功能的恢復〔3〕。SYN是分布于突觸囊泡膜上含量豐富的糖蛋白之一,影響著突觸可塑性，既是突觸發生的標志,又是突觸傳遞效能水平的反映，其免疫定位與定量可以準確反映突觸的分布與密度〔4〕。GAP-43是神經軸突生長和再生的特異性指標，是決定神經再塑的內在因素。目前對SHH 信號通路在腦缺血后突觸再生的研究甚少，本實驗擬用SHH信號通路的激活劑purmorphamine，觀察其對大鼠缺血腦組織突觸再生的相關因子SYN、GAP-43的影響，為缺血性腦血管病的神經功能恢復提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1材料 由實驗動物中心提供雄性SD大鼠76只，清潔級，體重280～350 g。purmorphamine粉劑(CAS Resistry NO.:483367-10-8)由上海浩然生物試劑有限公司提供。使用前先用DMF溶解，再用PBS溶液稀釋。SYN兔抗鼠多克隆抗體，由美國SANTA CRUZ提供。SP9000試劑盒、DAB試劑盒由北京中杉生物工程公司提供。PCR試劑盒、內參β-actin、DEPC水、逆轉錄試劑盒、Trizol由北京全式金生物技術有限公司提供。

1.2模型與分組 參照Zea longa〔5〕等報道的線栓法制作SD大鼠大腦中動脈缺血模型。實驗分為A組(假手術組，n=12)、B組(模型組，n=32)、C組(藥物組，n=32)。其中B組和C組按缺血時間分為4個亞組即6、24、72 h、7 d，每亞組8只。C組于術后按0.69/mg給予purmorphamine溶液腹腔注射，A組和B組于術后給予等劑量的DMF溶液注射。

1.3標本制備 10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛心臟灌洗固定24 h備用。石蠟包埋后連續切片，制備成4 μm厚度切片。

1.4免疫組化測定缺血半暗帶區域SYN和GAP-43的表達 采用SP法，按照說明書操作。每張切片隨機選取10×40視野5個，應用圖像分析系統得出陽性區平均灰度值。

1.5RT-PCR 檢測缺血半暗帶內GLi1 mRNA。10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取腦，液氮冷凍后放置-80℃冰箱保存。按試劑盒說明書提取腦組織總RNA，逆轉錄合成cDNA后進行擴增。上游引物為5'CCCTTCTTTAGGATTCCCACC3'，下游引物為5'CGGCAGTCCGTCTCATACAC3'，擴增條件:94℃預變性2 min，1個循環；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環；72℃總延伸6 min。實驗中以β-actin作為內參。GLi1擴增片段長度為324 bp，電泳鑒定后采用圖像分析系統進行半定量分析，計算目的基因GLi1與β-actin的DNA條帶灰度比值。

2 結 果

2.1GLi1 mRNA表達情況 與A組比較，B組和C組GLi1 mRNA表達均升高(P<0.05)；B組皮質缺血區GLi1 mRNA于6 h后開始升高，24 h達高峰，之后有所下降但維持在較高水平。C組各個時間點GLi1 mRNA與B組相比顯著增高(P<0.05)。見表1。

2.2SYN表達情況 可見棕黃色顆粒沉積在神經細胞表面，此為SYN 陽性表達，胞質中僅有較弱的反應。缺血側皮質區灰度值在6 h開始降低，72 h最顯著，7 d后開始上升，與A組相比各時間點明顯降低(P<0.05)。C組在缺血后6、24、72 h、7 d時SYN的表達明顯高于B組(P<0.05)。見表2，圖2。

表1 大鼠腦組織中各個時間點GLi1 mRNA 表達

表2 大鼠腦組織各時間點SYN表達(平均陽性區灰度值)

2.3GAP-43表達情況 可見皮質區GAP-43的免疫活性較其他部位高,呈小點狀或細顆粒狀沉積。A組大鼠在皮質和部分腦區GAP-43均有表達,且雙側對稱，在丘腦及其腦白質區GAP-43表達很低。其中缺血側皮質區GAP-43的免疫活性在缺血后6 h表達量開始上升，72 h升高最為顯著，7 d后開始下降，與A組相比差異有統計學意義(P<0.05)；C組大腦皮質GAP-43在6、24、72 h、7 d免疫活性明顯高于B組(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 大鼠腦組織各時間點GAP-43表達(平均陽性區灰度值)

A組

B組

C組

圖2 B、C兩組不同時點SYN表達(×400)

圖3 B、C組不同時點GAP-43表達(×400)

3 討 論

近年來，人們逐步認識到中樞神經系統具有可塑性，正是因為存在這種可塑性，才使得損傷后的腦組織能夠通過結構重建、功能代償使腦功能得到恢復。研究發現SHH信號通路與突觸再生有著密切的聯系，抑制SHH信號可以加重急性缺血性中風引起的腦損傷〔6〕。鞘內注射SHH蛋白增加了大腦室管膜下區神經祖細胞的增殖，促進中風后的功能恢復〔7〕。在參與突觸再生中，SHH可能是通過和受體Ptch結合引起Smo蛋白的活化，終于導致GLi鋅指轉錄因子家族的信號轉導，Gli家族包括GLi1、GLi2 和GLi3，GLi1的表達在Hedgehog信號通路起到始動開關的作用。 在突觸的發育中，SHH起著重要作用〔8〕，Tao-Cheng等〔9〕在成人的突觸內發現Ptch和Smo存在于突觸小泡中，參與突觸的再生。在缺血腦損傷初期，增加SHH蛋白能刺激突觸再生，為受損的組織提供營養及促進功能的恢復〔10〕。另外，SHH的神經保護作用可能通過多種機制增加神經祖細胞增殖〔11〕，其中包括抗氧化和抗凋亡，而且還可以通過其他受體的角色潛在的機制需要進一步研究。

purmorphamine是SHH信號轉導通路的激活劑，可與通路的Smo結合使其空間構象發生改變，進而激活下游分子GLi。本實驗發現在腦缺血后加入 purmorphamine 后激活了下游轉錄因子GLi1 mRNA 的表達，從而激活SHH信號轉導通路。SYN是一種與突觸結構和功能密切相關的鈣結合蛋白,是神經出芽反映的代表性結構蛋白,常被作為突觸重建和神經可塑性的重要標志物之一。GAP-43是神經組織中特有的一種糖蛋白，對神經系統發育過程中的軸突生長和突觸形成有重要作用〔12〕，在正常腦組織中GAP-43很少表達，只有在損傷情況下才增高。本研究發現腦缺血應用 SHH信號通路激活劑后，大鼠皮質缺血半暗帶區GAP-43、SYN免疫活性在各個時間點的表達明顯高于模型組，并且上調峰值，提示purmorphamine對腦缺血后大鼠腦的可塑性產生了影響，對大鼠腦缺血后神經細胞功能恢復及突觸代償有促進作用。推測激活SHH信號通路可能是一種潛在的腦血管病治療的新方法。

4 參考文獻

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