3種中藥復方對腦缺血再灌注大鼠腦組織細胞間黏附分子-1和血管內皮生子因子表達的影響

俞麗華 王 鍵 陳業農 胡建鵬

(安徽中醫藥大學中西醫結合臨床學院組胚生物教研室，安徽 合肥 230038)

腦缺血和缺血后再灌注損傷過程是極其復雜的病理生理過程〔1〕。中醫藥在其治療和預防方面取得了一些進展，但其病機復雜，其治法方藥呈現多樣性，目前療效仍不能令人滿意。本實驗通過觀察3種治法的代表中藥復方對模型大鼠細胞間黏附分子(ICAM)-1和血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達的動態影響，探討其在抗腦缺血再灌注損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物分組 健康Wistar雄性大鼠120只，250～300 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。隨機均分為5組(n=24)：假手術組、模型組、益氣活血組、潛陽熄風和化痰通腑組，每組再分缺血2 h再灌注24、48、72 h 3個不同時點，各時間點n=8。

1.2藥物與試劑 益氣活血法(選腦絡欣通)由黃芪、三七、川芎、蜈蚣等藥物配伍組成。潛陽熄風法：選用鎮肝熄風湯(懷牛膝30 g、生代赭石30 g、生龍骨15 g、生牡蠣15 g、生龜板15 g、生杭芍15 g、玄參15 g、天冬15 g、川楝子6 g、生麥芽6 g、茵陳6 g、甘草5 g)。化痰通腑法：選用星蔞承氣湯(全瓜蔞30 g、膽南星10 g、生大黃10 g、芒硝10 g)。中草藥由安徽中醫學院第一附屬醫院中藥房提供，中藥制劑室制劑，分別相當于原生藥6、14及4.8 g/ml。兔抗鼠ICAM-1一抗、兔抗鼠VEGF一抗、生物素化山羊抗兔二抗、免疫組化SABC試劑盒、DAB顯色劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3模型制備 采用大腦中動脈阻塞(MCAO)線栓法改良制作局灶性腦缺血再灌注動物模型，并判斷評分，2～3分入選。

1.4給藥方法與標本采集 藥物分別按腦絡欣通8.61 g·kg-1·d-1、鎮肝熄風湯20.3 g·kg-1·d-1及星蔞承氣湯7 g·kg-1·d-1灌胃給藥(相當于成人等效劑量7倍)。給藥時間：術前半小時給藥1次，以后每天早晚各1次，最后1次于處死前3 h給藥。分別在缺血2 h再灌注24、48、72 h 3個時間位點處死，造模前1 d晚禁食不禁水。手術組及模型組按同樣方法予以等量生理鹽水灌胃。在各個相應的時間位點前，以10%水合氯醛(350 ml/kg)腹腔注射麻醉動物，進行心臟內固定：打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導管至主動脈，向內迅速注入37℃肝素化生理鹽水約200 ml，至右心耳流出液變清亮，然后注入4%多聚甲醛約350 ml，灌流固定30 min后斷頭取腦，除去小腦和腦干，放入4%多聚甲醛中固定1 w，脫水、透明、浸蠟，從視交叉后連續制作腦部冠狀切片。

1.5免疫組織化學SABC染色法檢測大鼠腦組織ICAM-1和VEGF的表達 切片脫水至蠟，3%過氧代氫(H2O2)室溫10 min，去除內源性過氧化物酶；枸櫞酸鹽緩沖液修復抗原，以正常山羊血清封閉37℃，20 min；滴加適當稀釋的一抗ICAM-1、VEGF(1∶100)，4℃過夜。生物素化山羊抗兔二抗37℃孵育30 min；SABC復合工作液37℃，20 min。DAB顯色、蘇木精復染、脫水、透明及封片。陰性對照采用PBS替代一抗。

2 結 果

2.1各組大鼠對腦缺血2 h再灌注不同時間點大腦ICAM-1陽性細胞數 3個中藥復方治療組表達陽性細胞較模型組均顯著減少(P<0.01，P<0.05)，24 h真肝熄風湯組最優(P<0.05)，48 h星蔞承氣湯組優于其他治療組(P<0.01)；72 h各治療組無明顯差別，可是益氣活血組陽性細胞最少。見表1。

表1 各組大鼠的ICAM-1表達及VEGF表達陽性面積

2.2各組再灌注不同時間點VEGF免疫組化結果 各治療組各時間點大鼠缺血側腦組織均見大量VEGF陽性顆粒表達較假手術組增加(P<0.01)，24 h各組比較鎮肝熄、風湯優于其他組(P<0.01)，72 h星蔞承氣湯優于其他用藥組(P<0.05)。見表1。

3 討 論

研究表明〔2〕局灶性腦缺血和腦缺血后再灌注腦實質微血管內皮上ICAM-1表達增高。在大腦中動脈閉塞再灌注時12 h內明顯升高并達到高峰，持續5～7 d，ICAM-1表達主要位于腦實質血管內皮上〔3〕。 鑒于ICAM-1在介導缺血再灌注中白細胞損傷的作用，近年來已提出應用抗ICAM-1單克隆抗體來減輕及預防腦缺血再灌注損傷的設想，雖然尚未取得共識，但它的確為腦缺血治療研究開辟了新領域。研究表明〔4〕通過降低黏附分子含量從而抑制腦缺血再灌注損傷級聯反應,本研究表明假手術組有少量表達，模型組表達明顯升高，并于24 h達到高峰，這與文獻〔5〕報道不完全一致，可能與缺血時間和程度相關。

VEGF是高度特異性的內皮細胞有絲分裂原，它能夠特異性作用于血管內皮細胞，促進血管內皮細胞增殖及體內新生血管形成。VEGF在腦缺血中的保護機制有：①促進新生血管形成：研究證實，腦缺血后缺血區，特別是缺血半暗帶VEGF及其受體VEGFR-1和VEGFR-2通過低氧誘導因子(HIF)-1調節，表達上調，刺激內皮細胞增生，從而形成新的血管。研究還發現，缺血〔6〕和缺氧〔7〕大鼠VEGF表達的時空分布與血管生成呈正相關。VEGF在維持或恢復內皮細胞的完整性中起重要作用，VEGF可防止毛細血管消失，保護內皮細胞不致發生程序化死亡。②對神經元的直接保護作用：研究發現，將外源性VEGF蛋白應用于短暫性腦缺血大鼠腦表面，24 h梗死體積明顯縮小，腦水腫和神經元損傷減輕。故Jin等〔8〕指出，在血管形成之前，VEGF對神經系統起直接保護作用，這有助于延長細胞存活時間，直到血管形成發揮自身搭橋作用，誘導新血管形成，增加受損腦組織再灌注及供氧量，從而減輕腦血管再灌注損傷〔7〕。本結果提示3種中藥復方在腦缺血再灌注過程中通過上調VEGF，刺激腦組織建立側支循環減輕腦組織損傷。

研究表明〔9〕，中藥復方有多成分、多靶點、多效應性的特點，它的功效具有明顯的時效性。本研究表明3種中藥復方通過降低ICAM-1和升高VEGF表達抗腦血管炎癥損傷，保護血管內皮，延長腦細胞存活時間，促進新血管形成發揮自身搭橋作用，增加受損腦組織再灌注及供氧量。至于3種復方療效的時間差異可能是復方的成分和作用途徑的不同，也可能是腦缺血過程的證侯演變所致，其差異的真正原因還需進一步探討。

4 參考文獻

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