人參皂苷Rb3保護低糖低氧/復氧誘導乳鼠皮層神經元凋亡的離子通道機制

王巧云 劉 鳳 李金蓮 楊 靜

(濱州醫學院基礎學院，山東 煙臺 264003)

人參皂苷Rb3是五加科植物人參、西洋參、三七等的主要藥理活性成分，主要存在于人參的根、花蕾、莖葉和西洋參的根、莖葉以及三七的莖葉中?，F代科學研究發現人參皂苷Rb3可顯著保護腦缺氧缺糖導致的缺血損傷，機制可能保護線粒體功能、拮抗鈣離子、抑制細胞凋亡及caspase活性有關〔1，2〕。目前，mitoKATPC通道在心腦保護中的地位已引起廣泛關注，也有研究報道三七總皂苷(Rb3為主要成分之一)對心肌缺血再灌注損傷的保護作用與mitoKATPC開放有關。mitoKATPC是否也參與人參皂苷Rb3抗腦缺血缺性損傷的凋亡作用，尚未見報道。本研究以OGD/R皮層神經細胞為研究對象，觀察人參皂苷Rb3的抗凋亡作用及離子通道機制。

1 材料與方法

1.1實驗藥物 人參皂苷Rb3 (南京澤朗醫藥科技有限公司，純度為98%，批號： ZL201003)。

1.2動物 新生24 h Wistar大鼠，購自中國醫學科學院實驗動物研究所，合格證號：SCKX(京)2004-0001。

1.3試劑與儀器 MEM/F12培養基，購自Gibco公司；胰蛋白酶、Hochest 33342、5-HD，均購自Sigma公司；標準胎牛血清(FBS)、馬血清為Hyclone產品；兔抗大鼠 MAP-2抗體、羅丹明標記的羊抗兔 IgG二抗由北京中杉試劑公司提供；兔抗PARP 為Santa Cruz 產品；Caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；其他為國產分析純。倒置相差顯微鏡(OLYMPUS-IX71)，細胞培養箱(日本三洋公司)，Spectra Max M5 酶標儀(Molecular Devices 公司)，低溫離心機(德國Beckman 公司)。

1.4方法

1.4.1大鼠皮層神經元的原代體外培養及鑒定〔3，4〕

1.4.1.1包被培養板 細胞培養前2 h，用0.1‰多聚賴氨酸(PLL)包被24孔培養板，置5% CO2培養箱中，使用前用D-Hank′s液沖洗干凈。

1.4.1.2皮層的分離 取新生1 d的Wistar乳鼠，75%乙醇皮膚消毒后，剝離皮膚及顱骨，暴露并取出完整的腦組織，解剖顯微鏡下去除血管、腦膜及海馬，分離出皮層組織。

1.4.1.3消化 用眼科剪將皮層組織剪成直徑為1 3 mm3的小塊，剪碎后移入無菌離心管中。加入0.125%的胰蛋白酶4 ml， 37℃消化約20 min。然后以完全培養基終止消化，離心(1 000 r/min)10 min。

1.4.1.4細胞收集 棄去上清液，加入DMEM完全培養液3～5 ml，以吸管輕輕吹打細胞至細胞分散，然后經200目篩網過濾收集細胞。

1.4.1.5細胞計數 取樣，用計數器進行細胞計數，調整細胞濃度為106/L。接種1.0 ml/孔 于24孔培養板中，置5% CO2培養箱中，37℃培養。24 h后換液，以除去懸浮死亡的細胞。于接種的第3天，吸去培養基，加入終濃度為3 μmol/L的阿糖胞苷24 h(每孔1 ml)，以抑制非神經元生長。以后每周換液2次，每次換半液，定時在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況，并進行顯微攝影。培養置10～12 d開始試驗。

1.4.1.6大鼠皮層神經細胞的鑒定-微管相關蛋白2(MAP-2)熒光染色檢測 細胞培養第 10 天進行免疫細胞熒光染色檢測，以證實其性質及純度。過程如下：將培養液棄去，以 0.01 mol/L的PBS (pH 7.4，37℃)洗滌三次，4% 多聚甲醛室溫固定 20 min，0.3% Triton X-100 作用 15 min 將細胞穿孔，再由 PBS 孵育 3×3 min，吸棄 PBS，滴加一滴 10% 羊血清，孵育10 min后棄去，各孔加入兔抗大鼠 MAP-2抗體(1∶400)，4℃過夜，次日 PBS 沖洗后(3×10 min)，滴加第二抗體-羅丹明標記的羊抗兔 IgG(1∶800)，常溫孵育2 h，孵育結束前 20 min 加入2 μg/ml的Hoechest 33342。由 PBS 沖洗 4×10 min，吹干后立即由緩沖甘油封固，置熒光顯微鏡下觀察表達陽性的細胞，每孔隨機取6個視野，記錄3孔，計算陽性細胞數。

1.4.2原代神經元低糖低氧/復氧模型建立〔5〕制備模型前以無糖Earle′s平衡鹽緩沖液沖洗4次，每次為原完全培養基體積的2/3，使葡萄糖終濃度小于1 mmol/L。每孔加入100 μl 終濃度為10 mmol/L Na2S2O4無糖Earle液，于CO2培養箱中孵育2 h，取出并吸棄平衡鹽緩沖液，換以完全培養基，再置入CO2培養箱孵育24 h。

1.4.3實驗分組及給藥 將以上培養的細胞分為6組：正常對照組：正常換液培養；在制備OGD模型時同步換以含糖Earle液。低糖低氧再灌注損傷組(OGD/R)：終濃度為10 mmol/L Na2S2O4無糖Earle液，于CO2培養箱中孵育2 h，取出并吸棄平衡鹽緩沖液，換以完全培養基，再置入CO2培養箱孵育24 h，模擬體內缺血再灌注的過程。人參皂苷Rb3組、5-HD組：換以完全培養基后，分別加60 mol/L人參皂苷Rb3、5-HD，作用30 min后行OGD/R損傷。60 mol/LRb3+5-HD組：人參皂苷Rb3作用15 min后，加入5-HD，15 min后行OGD/R。

1.4.4熒光素染料Hoechst33342測定皮層神經元凋亡 模型制備結束，吸除培養液， PBS 清洗三次，加入染色液(Hoechst 33342/DMEM，5 μmol/L)，37℃、5% CO2培養箱避光染色10 min，無血清無酚紅培養劑清洗三次，于倒置熒光顯微鏡下觀察(激發波長在350 nm左右，發射波長在460 nm左右)細胞核染色情況。并于20×10高倍鏡下每個培養孔隨機取5個不同視野，計算凋亡率(凋亡細胞數/總細胞數)，以反應皮層神經元凋亡程度。

1.4.5Western 印跡檢測PARP的表達 細胞經處理后收集，細胞裂解液冰上裂解15 min，13 000 r/min離心20 min 后提取上清液即為細胞總蛋白質。每泳道取50 mg 蛋白質在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳， 將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，封閉液(TBS+5%脫脂奶+5% tween 20)室溫封閉1 h，加入一抗(1∶5 000兔抗PARP)封閉后，作用3 h，取出膜，用TBS-T漂洗膜10 min×3 次，洗滌后加入辣根過氧化物酶耦聯的二抗(1∶2 000)室溫封閉30 min。室溫搖床上持續平緩搖動1 h，TBS-T 漂洗膜10 min×3 次?；瘜W發光法(ECL) 曝光膠片，顯色檢測相應蛋白條帶。

1.4.6caspase-3 活性測定 活化的caspase-3 可催化底物Ac-DEVD-pNA，產生黃色的pNA，從而可以通過測定吸光度來檢測caspase-3 的活性。同上收集細胞總蛋白。caspase-3 活性檢測于96 孔板中進行，每孔加入待測樣品40 μl，caspase-3 底物20 μmol/L，終體積為100 μl，并設置空白對照。混勻后37℃孵育2 h，于405 nm 處測定OD值。實驗過程中同時制備pNA標準曲線。最終caspase-3的活性以正常對照組為標準，其余各組與之相比表示。

2 結 果

2.1大鼠原代皮層神經細胞體外培養及鑒定結果 神經細胞培養至第10天胞體飽滿，背景清晰，折光性強，突起分支較多且形成網絡(圖1)。MAP-2在神經細胞的胞漿和突起中呈陽性表達，其免疫熒光染色能夠反映出細胞性質及純度。對培養至10 d的大鼠皮層神經細胞進行細胞免疫熒光化學檢測，結果顯示細胞胞體飽滿，突起粗大，胞質內顆粒明顯，與形態學檢測結果相吻合，提示神經細胞生長良好。經鑒定，神經細胞的純度為 81.34%(圖1)。

圖1 原代培養大鼠皮層神經元(×400)

2.2熒光素染料Hoechst33342測定人參皂苷Rb3對OGD/R誘導皮層神經元凋亡的影響 Hoechst 33342是一種親嗜DNA 的熒光染料，與DNA 發生特異性結合后，在熒光顯微鏡下可檢測到藍色熒光，清楚地顯示核的形態、大小及核質的密度。正常細胞呈均勻的藍色熒光，細胞核膜光滑無皺縮、無濃縮及碎裂征，可見圓形細胞核；OGD/R損傷后，細胞核皺縮變小，密度增加，并發生濃縮，碎裂呈三角形、圓形或多邊形的團塊；正常對照組皮層神經元的凋亡率為(2.67±0.42)%，OGD/R組表現出明顯的細胞凋亡，凋亡率為(47.12±1.23)%；與OGD/R組比較，人參皂苷Rb3組(60 mol/L)可以降低OGD/R后皮層神經元的凋亡率(26.641±1.35)(P<0.01)。但5-HD則削弱了人參皂苷抗OGD/R損傷的細胞凋亡作用，使5-HD組及人參皂苷Rb3+5-HD組細胞凋亡率分別為(44.32±2.44)%及(37.12±1.23)%。見圖2。

2.3人參皂苷Rb3對OGD/R損傷后細胞中PARP的影響 如圖3所示，在正常培養的神經細胞中，PARP表達較高(1.00±0.03)；而OGD/R損傷后，PARP的表達明顯減低(0.58±0.13)，提示表明其完整性被破壞；人參皂苷Rb3作用后明顯提高了PARP的表達水平(0.88±0.07)，與OGD/R損傷組相比具有顯著的統計學差異(P<0.01)，提示人參皂苷Rb3能夠通過維持PARP的完整性而對皮層神經細胞發揮保護作用。5-HD亦使PARP的完整性受到破壞，與OGD/R組無顯著性差異(0.64±0.07,P>0.05)。但5-HD減弱了人參皂苷Rb3引起的PARP完整性作用(0.76±0.04,P<0.01)。

圖2 Hoechst 33342染色示OGD/R誘導致皮層神經元細胞核的形態學改變(×400)

A：正常對照組；B：OGD/R組；C：人參皂苷Rb3組；D：5-HD組;E：人參皂苷Rb3+5-HD組

2.4人參皂苷Rb3 對OGD/R損傷后細胞中caspase-3活性的影響 在正常情況下，caspase-3 活性較低(1.00±0.04)；OGD/R后，神經細胞內caspase-3 的活性明顯升高(3.53±0.19)，約為損傷組的3.14 倍；人參皂苷Rb3明顯降低了caspase-3 的活性(1.71±0.13,P<0.01)。而應用5-HD后，caspase-3 的活性增高，與OGD/R損傷組相比無統計學差異(3.08±0.12,P>0.05)。但5-HD削弱了人參皂苷Rb3對caspase-3活性的抑制作用，使caspase-3活性約增加1.43倍(2.45±0.16)。

3 討 論

mitoKATP是一種存在于心肌細胞線粒體膜上的主要鉀通道，近年來，mitoKATP的激活在腦缺血缺氧保護中的作用越來越引人注目，大量研究顯示在腦缺血缺氧過程中，mitoKATP開放，K+內流，膜去極化，減輕線粒體內Ca2+超載；減少自由基損傷，維持線粒體膜穩定性，延緩和減輕細胞凋亡〔6，7〕。

本研究通過缺氧復氧成功誘導了乳鼠神經元凋亡，通過DNA熒光染色Hoechst染色觀察到人參皂苷Rb3干預后對體外培養神經細胞凋亡影響。實驗發現，人參皂苷Rb3可以明顯降低缺氧/復氧后神經元的凋亡率，改善細胞形態。在應用人參皂苷Rb3預處理的同時應用mitoKATPC特異阻斷劑5-HD則消弱了其抑制神經元凋亡作用。

PARP是定位在細胞核內，在應激條件下與DNA修復密切相關的一種酶，它的存在對于細胞的穩定和存活非常重要。PARP在體外可以被多種caspases剪切，在體內則是caspase-3的主要剪切對象，因此，PARP的剪切被認為是細胞凋亡的一個重要指標，也通常被認為是caspase-3激活的指標。在正常培養的神經細胞中，PARP表達較高，caspase-3活性也較低；而OGD/R損傷后，PARP的表達明顯減低，提示其完整性受到破壞，同時凋亡蛋白caspase-3活性增強，神經元凋亡率增高；人參皂苷Rb3明顯提高了PARP的表達水平，降低了caspase-3活性，與OGD/R損傷組相比具有顯著統計學差異。而5-HD則削弱了人參皂苷Rb3對PARP完整性的維持，增強了caspase-3的活性，促使神經元凋亡，即5-HD抑制了人參皂苷Rb3的抗凋亡作用。由此推測，人參皂苷Rb3可能通過開放mitoKATPC，抑制激活的caspase-3對其特異性底物進行裂解而緩解細胞凋亡，起到腦缺血保護。

4 參考文獻

1李桂生，田京偉，傅風華，等.人參皂苷Rh3對腦缺血大鼠腦線粒體損傷的保護作用〔J〕.中國新藥雜志,2006；15(7)：518-21.

2Zhu JR，Tao YF，Lou S，etal.Protective effects of ginsenoside Rb(3) on oxygen and glucose deprivation-induced ischemic injury in PC12 cells〔J〕. Acta Pharmacol Sin,2010;31(3):273-82.

3Ban JY，Jeon SY，Nguyen TT,etal.Neuroprotective effect of oxyresveratrol from smilacis china erhizome on amyloid Beta protein (25-35)-induced neurotoxicity in cultured rat cortical neurons〔J〕.Biol Pharm Bull， 2006;29(12)：2419-24.

4Rui Liu，Mei Gao，Zhi-Hong Yang,etal.Pinocembrin protects rat brain against oxidation and apoptosis induced by ischemia-reperfusion both in vivo and in vitro〔J〕.Brain Res， 2008;1216(8):104-15.

5Sun Y，Tian YK，Wang P.Rat hippocampal neuron culture in vitro〔J〕. Chin J Anesthesiol，2004；5(24)：396-7.

60′Rourke B.Evidenee for mitochondrial K+channels and their role in cardioprotection〔J〕.Cric Res，2004;94(4)：420-32.

7Xu M，Wang Y，Ayub A，etal.Mitochondrial KATP channel activation reduces anoxic injury by restoring mitochondrial membrane potential〔J〕. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001;281(3)：1295-303.