依達拉奉對認知功能障礙小鼠海馬氧化應激及神經元再生的影響

孫 健 李 昱 賈 舒 宋貴軍

(大連醫科大學附屬第二醫院血液內科，遼寧 大連 116027)

認知功能障礙是多種神經疾病的常見表現，影響了患者生活質量、增加家庭負擔，甚至可發展為阿爾茨海默病〔1〕。除神經系統退行性疾病外，外傷及腦出血也可導致認知障礙，其中病變神經元未能完成被新生神經元替代是影響認知功能恢復的關鍵〔2〕。海馬在調控認知的關鍵部位，該部位的神經元再生情況是近年來的研究熱點〔3〕。氧化應激在認知障礙發生發展中起重要作用，研究指出給予外源性自由基可促進神經元再生，而在阿爾茨海默病模型中給予自由基清除劑可減弱Aβ誘導的細胞毒性，提示抗氧化是改善認知障礙的可行措施〔4〕。依達拉奉(ED)是一種自由基清除劑，具有神經保護作用，并推測其可能對認知功能障礙的學習記憶功能損傷及神經元再生有改善作用。本研究擬觀察ED對學習記憶功能及海馬神經元再生的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取健康雄性ICR小鼠30只(購于北京維通利華公司)，體重25～30 g，采用側腦室注射Aβ25～35制備認知障礙模型，隨機分為：模型組、ED低劑量(ED-L)組和高劑量(ED-H)組。其中ED-L組和ED-H組均在側腦室注射1 w后腹腔注射5 mg/kg和10 mg/kg ED(1次/d，連續4 w)，模型組僅給予等體積生理鹽水。同時選取10只同周齡ICR小鼠作對照(對照組)。實驗前所有大鼠均飼養穩定1 w，各組大鼠均可自由獲取食物和水，且飼養條件相同。

1.2試劑 Aβ25～35購自美國Sigma公司；BCA蛋白分析試劑盒，碧云天生物科技公司；丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；腦源性神經營養因子(BDNF)檢測試劑盒購自博士德生物技術有限公司，依達拉奉注射液購自江蘇先聲藥業生產公司，其他試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1認知障礙小鼠模型制備 將預先溶解于雙蒸水中的Aβ25～35肽段(3 mmol/L)在37℃水浴中孵育，96 h后用于側腦室注射。待小鼠狀態穩定后，給予2%水合氯醛腹腔麻醉(10～20 ml/kg)，待角膜反射消失后，置于立體定位儀，顱頂正中切開長約2 cm切口，暴露顱底頂，以前囟點為原點，根據小鼠側腦室坐標(前囟點后0.3 mm，右側1 mm，深2.5 mm)微量注射Aβ25～35(總量約為5 nmol，體積控制在3 μl內)，留針不少于3 min，保證Aβ25～35進入側腦室。對照組的手術操作步驟相同，僅注射等體積的生理鹽水。術后縫合皮膚及常規消毒。

1.3.2學習和記憶功能檢測 采用Y型迷宮檢測各組小鼠的學習和記憶功能。預先將小鼠置于迷宮內以適應環境，3～5 min后給予適當電壓電擊足部(約70 mV)，導致其向迷宮的3等分輻射式反射箱逃避，反射箱的3個輻射臂中僅有1個為安全，內置于輻射臂中的信號燈亮提示安全。小鼠由電擊區域逃至無電輻射臂定義為正確反應，其中連續10次中有9次正確反應所需電擊次數為學習成績，而連續10次測試中的正確反應次數為記憶成績，分別用于評價學習能力和記憶能力。

1.3.3ELISA法檢測海馬MDA、BDNF水平及SOD活性 將完成Y型迷宮的小鼠過量麻醉處死，迅速取出腦，用預冷PBS溶液沖洗血漬，放入液氮達到適當硬度，取出海馬部位，冰上研磨并充分裂解，高速離心(12 000 r/min×20 min)，小心吸出上清液并等分為3份，分別用于檢測MDA、BDNF水平及SOD活性，所有操作嚴格按照試劑盒說明書。

1.3.4神經元再生及活性氧檢測 用冰凍切片機對海馬進行冠狀連續切片(40 μm)，每5張保留1張，每個海馬取8張片，分別行特異性熒光探針DHE染色和DCX染色，置于高倍顯微鏡下，觀察各組的熒光強度、神經元前體細胞的長度和密度。

2 結 果

2.1各組的學習和記憶成績 模型組的學習次數多于對照組，而記憶次數小于對照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導認知障礙引起的學習次數增多和記憶次數減少，ED-L組和ED-H組的學習次數少于模型組，記憶次數多于模型組(P<0.05)，但仍與對照組有差異；ED-H組對學習和記憶成績的改善效果強于ED-L組(P<0.05)，見表1。

表1 四組小鼠的學習和記憶成績±s,n=10)

2.2各組海馬MDA、BDNF水平及SOD活性 模型組的海馬MDA水平高于對對照組，BDNF水平和SOD活性均低于對照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導認知障礙引起的MDA水平升高及BDNF水平和SOD活性降低， ED-L組和ED-H組的MDA水平低于模型組，BDNF水平和SOD活性均高于模型組(P<0.05)，但仍與對照組有差異；ED-H組對MDA、BDNF水平及SOD活性的改善效果強于ED-L組(P<0.05)，見表2。

表2 四組小鼠海馬的GAP-43、MDA水平及SOD活性±s,n=10)

2.3各組海馬的活性氧自由基水平比較 模型組的海馬熒光強度強于對照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導認知障礙引起的熒光強度增強，ED-L組和ED-H組的熒光強度均低于模型組(P<0.05)，但仍與對照組有差異；ED-H組對海馬增強熒光強度的減弱效果強于ED-L組(P<0.05)，見表3。

表3 四組小鼠海馬的DHE和DCX染色情況±s,n=10)

2.4各組海馬神經元前體細胞的神經突起長度和密度 模型組海馬神經元前體細胞的神經突起長度和密度均低于對照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導認知障礙引起的海馬神經元前體細胞的神經突起長度和密度降低，ED-L組和ED-H組的神經突起長度和密度均高于模型組(P<0.05)，但仍與對照組有差異；ED-H組對神經突起長度和密度的改善作用均強于ED-L組(P<0.05)，見表3。

3 討 論

ED是一種自由基清除劑，在臨床上用作腦保護劑，可保護神經免受缺血缺氧導致的損傷。此外，其在臨床和動物試驗中對急性缺血性腦血管病有非常好的療效，并在其他神經系統疾病如帕金森病、肌萎縮側索硬化癥也有滿意的治療作用〔6，7〕。除可減弱Aβ誘導的細胞毒性外，ED還可降低NMDA誘導的cyt c釋放和細胞凋亡〔8〕。以上均提示ED在改善認知障礙上有一定的應用前景。

本研究發現：Aβ25～35處理可誘導認知障礙，主要原因為Aβ25～35是淀粉樣蛋白的一種片段，可引起神經系統退行性改變，如神經元胞體死亡、突觸丟失及繼發的學習記憶功能受損〔9〕。而給予ED處理后，Aβ25～35誘導認知障礙成功后出現的學習記憶功能獲改善，提示ED對認知障礙有改善作用，與之前的推測一致。此外，本研究還發現Aβ25～35處理后海馬神經元前體細胞的神經突起長度和密度均降低，而神經元前體細胞是神經元再生的基礎，表明認知障礙小鼠的神經元再生受抑制，是導致Aβ25～35處理小鼠出現學習和記憶成績下降的根本原因，而給予ED處理后，可發現海馬神經元前體細胞的突起長度和密度增加，同時BDNF水平升高，表明ED可促進海馬部位神經元再生。

氧化應激導致的自由基損傷在多種疾病的認知障礙中有重要作用，而MDA水平和SOD活性是評價氧化應激的經典指標〔10，11〕。本研究中Aβ25～35處理小鼠的MDA水平升高，SOD活性下降，提示Aβ25～35處理引起氧化應激，ED處理后兩者異常水平均獲改善，表明ED對認知障礙小鼠的海馬神經元氧化應激有改善作用，可能是其提高學習記憶功能及促進海馬神經元再生的基礎。

綜上，ED可改善認知功能障礙小鼠的學習和記憶功能，可能是通過降低氧化應激及促進海馬神經元再生來實現的。

4 參考文獻

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