婦科千金片對大鼠慢性盆腔炎模型輸卵管組織Caspase-3和Caspase-8表達的影響

,3 ,2,4* ,2

1.湖南中醫藥大學中藥現代化研究重點實驗室，湖南 長沙 410208;2.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208;3.湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，湖南 長沙 410007;4.國家中醫藥管局中藥藥性與藥效實驗室三級科研實驗室，湖南 長沙 410208

婦科千金片對大鼠慢性盆腔炎模型輸卵管組織Caspase-3和Caspase-8表達的影響

聶晶1李鑫1,3師振予1,2,4*郭建生1,2

1.湖南中醫藥大學中藥現代化研究重點實驗室，湖南 長沙 410208;2.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208;3.湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，湖南 長沙 410007;4.國家中醫藥管局中藥藥性與藥效實驗室三級科研實驗室，湖南 長沙 410208

目的通過觀察婦科千金片對SD大鼠慢性盆腔炎模型中輸卵管組織Caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白表達影響，深入探討婦科千金片治療慢性盆腔炎的作用機制。方法采用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及解脲脲原體混合菌接種法，建立慢性盆腔炎模型，隨機分成七組：空白組，模型組，假手術組，中藥婦炎康(0.41g·kg-1)對照組，和婦科千金片低劑量組(0.52g·kg-1)、中劑量組(1.04g·kg-1)、高劑量組(2.08g·kg-1)。經藥物治療后，解剖大鼠取輸卵管組織，運用免疫細胞化學法觀察Caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白表達情況。結果治療21d后，與模型組比，婦科千金片低劑量組Caspase-3蛋白光密度值升高，具有明顯差異(P<0.05)，婦科千金片中、高劑量Caspase-3蛋白光密度值明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)；與模型組比，婦科千金片低、中、高劑量Caspase-8蛋白光密度值明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)。結論婦科千金片可能通過升高Caspase-3蛋白和Caspase-8蛋白的表達，引發Caspase級聯反應，促使炎性細胞凋亡，從而減輕輸卵管組織炎性損害。

婦科千金片；慢性盆腔炎；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-8

盆腔炎(Pelvic Inflammatory Disease, PID)是指女性生殖器官以及其周圍結締組織、盆腔腹膜發生的炎癥，臨床上根據其危急程度和進展分為急性盆腔炎和慢性盆腔炎。慢性盆腔炎(Chronic Pelvic Inflammatory Disease，CPID)主要包括慢性輸卵管炎與輸卵管積水、輸卵管卵巢炎及輸卵管卵巢囊腫、慢性盆腔結締組織炎[1]。因CPID反復發作，經久不愈，病情遷移，導致不孕不育、盆腔黏連性疾病等后果嚴重，其治療是一個很棘手的問題。婦科千金片在臨床中使用廣泛，對急慢性盆腔炎、子宮內膜炎等婦科常見病具有顯著療效[2-3]。我們前期研究，發現婦科千金片對急性盆腔炎大鼠通過調節免疫球蛋白，提高機體免疫能力[4]，保護大鼠子宮、輸卵管、卵巢等盆腔組織[5]，還可以通過調控基因轉錄環節，降低大鼠子宮、輸卵管組織IL-6mRNA、NF-κB蛋白，發揮抗炎免疫作用[6-7]。本研究擬觀察婦科千金片對大鼠慢性盆腔炎模型輸卵管組織Caspase-3和Caspase-8蛋白表達影響，進一步驗證婦科千金片在治療慢性盆腔炎方面的療效并探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物 雌性SD大鼠，SPF級，體質量(200±20)g，購自長沙斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2009-0004。

1.2 主要儀器 JY3002型電子天平；Shandon325型石蠟切片機；Motic B5顯微攝像系統等。

1.3 藥品及主要試劑 婦科千金片：株洲千金藥業股份有限公司，批號20110901；婦炎康片：湖南湘泉制藥有限公司，批號111105。Caspase-3免疫組化試劑盒，caspase-8免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 菌株 大腸桿菌(Escherichia coli，菌種號26002)，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，菌種號44152)，解脲脲原體(M.urealyticum，菌種號52011)，由湖南中醫藥大學免疫與微生物教研室伍參榮教授惠贈。

2 實驗方法

2.1 慢性盆腔炎模型制備 參考文獻方法[8-9]，用注射器分別抽取等體積的濃度為1×109CFU的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和解脲脲原體菌液，注入無菌培養皿中，混合均勻。將醫用明膠片剪成大小0.5cm×0.5cm的方塊，置于混合菌液中，使其充分接觸。明膠充分飽和后，左手持鼠尾，將大鼠倒立，右手夾含混合菌液的明膠塊經陰道塞至宮腔內，左右各1塊，并保持大鼠倒立1～2min。隔天1次，連續4次。假手術組塞入不含菌液的明膠塊。

2.2 動物分組及給藥 將成功建立的模型組大鼠按體質量隨機分為7組，每組10只。婦科千金片組高、中、低劑量分別按2.08，1.04和0.52 g·kg-1ig給予相應濃度的藥液，婦炎康組按0.41g·kg-1給予婦炎康藥液，空白對照組、假手術組及模型組分別給予等容積蒸餾水，ig給藥，1次·d-1，連續21d。

2.3 大鼠慢性盆腔炎模型輸卵管組織中Caspase-3和Caspase-8表達情況測定 解剖大鼠，取大鼠輸卵管組織，用體積分數10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋、切片。利用免疫組織化學法檢測輸卵管組織Caspase-3和Caspase-8表達情況。

2.4 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行數據統計，數據均以表示，進行方差齊性檢驗，呈正態分布，采用單因素方差分析；呈非正態分布，則采用秩和檢驗。(P<0.05具有統計學意義，P<0.01具有顯著統計學意義)。

3 結果

婦科千金片對大鼠慢性盆腔炎模型輸卵管組織Caspase-3和Caspase-8表達情況與空白組比較，模型組大鼠輸卵管組織Caspase-3蛋白表達有顯著性差異(P<0.01)。經婦科千金片治療后，與模型組相比，婦科千金片低劑量Caspase-3蛋白有顯著性升高(P<0.05)，婦科千金片中、高劑量組Caspase-3蛋白的表達也有顯著性升高(P<0.01)。

與空白組比較，模型組大鼠輸卵管組織Caspase-8蛋白表達有顯著性差異(P<0.01)。經婦科千金片治療后，與模型組相比，婦科千金片低、中、高劑量組Caspase-8蛋白的表達有顯著性升高(P<0.01)。見表1。

表1 婦科千金片對caspase-3蛋白和caspase-8蛋白光密度的影響

注：與空白組相比▲P<0.05,▲▲P<0.01；與模型組相比★P<0.05,★★P<0.01

4 討論

近年來研究發現，在組織損傷過程中巨噬細胞識別吞噬中性粒細胞，避免炎癥反應發生，半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific protease，caspase)在其細胞凋亡過程中有重要意義。其中Caspase-3、8蛋白的表達有促進凋亡作用，Caspase-3、8蛋白觸發炎癥細胞凋亡是促進炎癥恢復的機制之一。李華等[10]發現，手術組大鼠脊髓全橫斷損傷后脊髓灰質白質均檢測到凋亡細胞，Caspase-3在損傷周圍組織呈陽性，同時對比手術組Caspase-3表達顯著高于假術組。在慢性炎癥由發生、發展過程中T細胞的活化發揮重要作用，而Caspase-8是T細胞的活化中重要因子。T細胞活化過程中檢測到多種Caspases活性。Alam[11]用抗CD3抗體刺激人外周血單核細胞，發現Caspase-8被活化，同時還檢測到其下游的Caspase-3的活性。在本研究中，在空白組輸卵管組織中Caspase-3、8蛋白的光密度最低，提示Caspase-3、8蛋白在正常組織中含量較少。慢性盆腔炎模型組織中Caspase-3、8蛋白的光密度值明顯高于空白組，具有高度統計學意義(P<0.01)，證明Caspase-3、-8蛋白在炎癥反應中其表達上調，與文獻報道一致[12]。婦科千金片治療后，與模型組比，婦科千金片低、中、高劑量組Caspase-3、Caspase-8蛋白光密度值明顯升高，具有高度統計學意義(P<0.01)，證明婦科千金片可以促進Caspase-3、Caspase-8蛋白的表達。慢性炎癥由活化的T細胞介導，提示在慢性盆腔炎模型中，婦科千金片可能通過活化T細胞，TNF與TNFR-1結合，下傳凋亡信號，進而激活Caspase-8再活化Caspase-3,引起Caspases級聯反應。通過此途徑激發炎性細胞凋亡，使慢性炎癥吸收消散，減輕輸卵管組織炎性損傷，促進輸卵管炎癥恢復。

[1]樂杰．婦產科學[M]．5版．北京：人民衛生出版社，2002，295-303．

[2]張宇虹.婦科千金膠囊在慢性盆腔炎合并卵巢囊腫中的應用[J].中醫中藥，2012，50(21)：75-76.

[3]俞鳳英，周柳娟. 婦科千金片聯合抗生素治療急性盆腔炎臨床觀察[J].中國中醫急癥，2013，6(22)：992-993.

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[5]師振予,郭建生,袁建菱,等.婦科千金片對急性盆腔炎模型大鼠外周血細胞及盆腔組織病理改變的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(21):199-202.

[6]魯耀邦,屈金艷,郭建生，等.婦科千金片對急性盆腔炎大鼠子宮、輸卵管TNF-α、IL-2mRNA轉錄水平的影響[J].中成藥,2012,34(1):29-33.

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[11]Alam A, Cohen LY, Aouad S, et a1．Early activation of caspases during Tlymphocyte stimulation results in selective substrate cleav-age In nonapoptltie cells [J]．J Exp Med, 1999, 190(12):1879-1890.

TheinfluenceofFukeQianjinTabletstorat’sCaspase-3andCaspase-8expressionofthefallopiantubeswithchronicpelvicinflammatorydisease

NIE Jing1，LI Xin1,3，SHI Zhenyu1,2,4*， GUO Jiansheng1,2

1. Key Laboratory of Modernization of Chinese Medicine，Hunan University of Chinese Medicine , Chang sha 410208 ,China；2.Shools of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine , Chang sha 410208 ,China；3. Institute of Traditional Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Chang sha 410007, China

Objective To study the influence of FukeQianjin Tablets to rat’s Caspase-3 、Caspase-8 expression of the fallopian tubes with chronic pelvic inflammatory disease. Method The rats were established by mixed bacteria of Escherichia coli ,Staphyloccocusaureus and M.urealyticum. The rats were randomly divided into 7 groups :the control group, the model group，the low dosage group, the middle dosage group and the high dosage group of FukeQianjin Tablets, Fuyankang group. FukeQianjin Tablets in high, middle and low dosage were used to treat chronic pelvic inflammation model rat for 21days. Takes rat’s the fallopian tubes , the expression of caspases-3 and caspases-8 was detected by immunocytochemistry. Results After 21 days, Compared with model group, the expression of caspases-3: the FukeQianjin Tablets in low dosage groups were higher than in model group(P<0.05)，the FukeQianjin Tablets in middle and high dosage groups were markedly higher than in model group(P<0.01); the expression of caspases-8 :the FukeQianjin Tablets groups were markedly higher than in model groups(P<0.01)Conclusion FukeQianjin Tablets may improve the expression of caspases-3、caspases-8, produce Caspase cascade, make inflammatory cells to apoptosis, relieve ovarian tissue inflammatory pathological damage eventually.

FukeQianjin Tablets;； chronic pelvic inflammatory disease； caspase-3 ；caspase-8

湖南省高校創新平臺開放基金(10K045)。

聶晶，女，碩士，E-Mail:niejing2007521@sina.com。

師振予，女，博士，講師，E-mail:helenszy@hotmail.com。

R285.6

A

1007-8517(2014)09-0008-03

2014.03.09)