BDNF基因多態(tài)性與散發(fā)性阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能的相關(guān)性研究

李家鑫 祭健予 李 劍 歐俐羽 韋斌垣

·論著·

BDNF基因多態(tài)性與散發(fā)性阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能的相關(guān)性研究

李家鑫 祭健予 李 劍 歐俐羽 韋斌垣

目的 探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因功能性多態(tài)(rs6265)與散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)發(fā)病的相關(guān)性。方法 選取58例散發(fā)性阿爾茨海默患者(SAD組)與52例健康老年人(對照組),用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù), 對BDNF基因rs6265, 進(jìn)行基因型檢測, 同時(shí)利用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對兩組患者的血清BDNF水平進(jìn)行檢測。結(jié)果 在<60歲的人群中, 等位基因(χ2=6.0595, P=0.013)及基因型(χ2=6.0826, P=0.0478)在兩組人群中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 并且SAD的AA基因型患者的血清BDNF水平最低［(14.32±4.21)ng/ml, F=7.2545, P=0.0016］。結(jié)論 BDNF基因功能性多態(tài)rs6265與SAD發(fā)病相關(guān), 并且影響其血清BDNF的表達(dá)。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；阿爾茨海默病；功能性多態(tài)性

阿爾茨海默病(AD)是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病, 臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶障礙、認(rèn)知障礙和精神異常。腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)能夠支持前腦、海馬及皮質(zhì)膽堿能神經(jīng)元的生存、分化和修復(fù), 并且在突觸可塑性中發(fā)揮了重要的作用, 因此與學(xué)習(xí)和記憶有著密切的聯(lián)系。據(jù)報(bào)道, BDNF參與了AD的發(fā)病［1］, 因此本文將從BDNF基因的功能性多態(tài)(rs6265)層面來探討B(tài)DNF與散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)患者認(rèn)知功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2010年1月~2011年3月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和江濱醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的SAD患者58例, 其中男性40例, 女性18例, 年齡57~76歲, 平均(66.66±11.82)歲, 病程1~16年, 平均發(fā)病年齡(63.03±7.24)歲, 平均病程(6.62±4.565) 年。所有患者均進(jìn)行了臨床檢查、簡易智能狀態(tài)檢查(mini-mental state examination, MMSE)、Hachinski缺血評分和畫鐘測驗(yàn)(clock drawing test, CDT), 并經(jīng)過至少2名神經(jīng)科專家診斷, 所有AD患者均符合NINCDS-ADRDA“很可能AD”診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。所有SAD患者均除外患嚴(yán)重軀體疾病、有抑郁癥狀和癡呆家族史者。對照組為同期52例在本院行體檢的健康老年人, 其中男性33例, 女性19例, 年齡56~74歲, 平均(63.75±9.14)歲。SAD組和對照組患者在年齡(U=0.9532, P=0.3398)、性別構(gòu)成(χ2=0.3721, P=0.5412)及受教育程度(年)上［(12.65±5.72) VS (13.14±4.77), t=0.4848, P=0.6288］上均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要材料 MJ PTC-220 PCR儀; 紫外光凝膠電泳成像分析系統(tǒng); 血液基因提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司), 2×TaqPCRMasterMix (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司), 瓊脂糖(北京天根生化科技有限公司), gene finder核酸染料(Takara公司), 5×TBE ［生工生物工程(上海)有限公司］, DNA marker(600bp)(廣州東盛生物科技有限公司), Eco72I快速酶(Thermo公司)；人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)快速檢測試劑盒(CUSABIO, CSB-E04501h), Bio-RAD imark酶標(biāo)儀。

1.3 血樣采集 所有患者均空腹采取靜脈血5 ml, 將其中的2 ml沿管壁緩慢注入含肝素抗凝管中, 立即于-70℃冷凍存放以行基因檢測；余下的緩慢注入非抗凝管中, 室溫放置60 min后以1000 r/min離心20 min, 取血清分裝于EP管中,置-70℃低溫冰箱保存, 以檢測BDNF。

1.4 基因檢測 使用血液DNA提取試劑盒(離心柱型)提取血液DNA。BDNF基因G196A上游引物:5‘-AAGAAGCAAACATCCGAGGACA-3’, 下游引物:5‘-GGGATTGCACTTGGTCTCGTAG-3’, 引物由深圳華大基因科技有限公司合成。然后應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCRRFLP)技術(shù)擴(kuò)增目的DNA片段并進(jìn)行基因分型。PCR擴(kuò)增循環(huán)條件：94℃起始5 rain, 94℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 循環(huán)反應(yīng)35次, 72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Eco72I快速酶切, 酶切產(chǎn)物即刻進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳, 在紫外光凝膠電泳成像分析系統(tǒng)上進(jìn)行掃描、拍照,并進(jìn)行圖像分析, 對BDNF G196A進(jìn)行基因分型。

1.5 BDNF的檢測采用人BDNF ELISA試劑盒測定, 按說明書操作, 最后用酶標(biāo)儀讀數(shù), 取單波長450 nm, 用空白孔調(diào)零, 然后測定各孔光密度(OD值)。用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式, 將樣品的OD值代入方程式, 計(jì)算出樣品濃度, 再乘以稀釋倍數(shù)2, 即為樣品的實(shí)際濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件, 在檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05的基礎(chǔ)上, 兩樣本均數(shù)的比較以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差s)表示, 采用t檢驗(yàn), 兩樣本構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn)；基因型頻率和基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法, 吻合度檢驗(yàn)確定是否符合Hardy-Weinberg平衡。P<α表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BDNF多態(tài)性位點(diǎn)分析 BDNF G196A位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的酶切電泳結(jié)果：PCR產(chǎn)物長度為500 bp, 當(dāng)?shù)任换驗(yàn)镚時(shí), PCR產(chǎn)物經(jīng)Eco72I酶切后形成131 bp和369 bp片段, 在凝膠電泳圖上顯示2條電泳帶；當(dāng)?shù)任换驗(yàn)锳時(shí)PCR產(chǎn)物不能被Eco72I酶切, 片斷長度為500 bp, 在凝膠電泳圖上顯示1條電泳帶；當(dāng)?shù)任换驗(yàn)殡s合型A/G時(shí), 在凝膠電泳圖上顯示3條電泳帶, 見圖1。

圖1 BDNF G196A酶切圖譜

2.2 BDNFVal66Met多態(tài)性檢測

2.2.1 Hardy-Weinberg 吻合度檢驗(yàn) SAD組與對照組3種基因型觀察值與期望值檢測符合Hardy-Weinberg平衡定律(SAD組χ2=0.064, P=0.800；對照組χ2=0.076, P=0.783), 表明其基因型頻率分布已達(dá)到遺傳平衡, 具有群體代表性。

2.2.2 BDNF G196/A多態(tài)性與SAD的相關(guān)性分析 見表1, SAD組和對照組中AA、AG及GG 3種基因型頻率 (χ2=0.0129, P=0.994)和A、G等位基因頻率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.0128, P=0.910)。

2.3 血清BDNF的表達(dá) SAD組患者的血清BDNF水平(17.21±3.15)ng/ml明顯比對照組(21.85±5.42)ng/ml的低(U=5.4085, P＜0.001)；在SAD組中, AA基因型的患者, 其血清BDNF水平(14.32±4.21)ng/ml均比AG基因型患者(17.05±3.53)ng/ ml和GG基因型患者(19.42±3.36)ng/ml的要低(F=7.2545, P=0.0016), 提示了基因的表達(dá)影響了BDNF的表達(dá)。

2.4 SAD患者認(rèn)知功能評估 如表2所示, 3種基因型的患者認(rèn)知功能評估中, 定向力、語言能力、視空間覺以及畫鐘試驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 而瞬時(shí)記憶力、注意力計(jì)算力及短時(shí)記憶差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 其中以A/A基因型患者的最低。

表1 BDNF基因的功能性多態(tài)(rs6265)等位基因及基因型在SAD和正常者中的分布比較

表2 不同基因型患者的認(rèn)知功能的比較(s)

表2 不同基因型患者的認(rèn)知功能的比較(s)

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3 討論

認(rèn)知功能包括定向、注意、記憶、計(jì)算、分析、綜合、理解、判斷、結(jié)構(gòu)能力、執(zhí)行能力等, 如果多個(gè)認(rèn)知域發(fā)生障礙,則為認(rèn)知功能障礙［3］。SAD的認(rèn)知功能損害在疾病的不同階段表現(xiàn)不同, 早期主要為記憶障礙, 以延遲記憶障礙明顯,同時(shí)伴有注意、計(jì)算及執(zhí)行功能等障礙。在中晚期, 可出現(xiàn)遠(yuǎn)期記憶障礙, 分析、理解和判斷能力障礙, 甚至出現(xiàn)人格改變和精神癥狀等。而BDNF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子中的一個(gè)重要成員, 除具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)生、發(fā)展及維持的基本作用外,還可通過調(diào)節(jié)突觸可塑性影響學(xué)習(xí)和記憶等功能［4］。

單核苷酸多態(tài)性是人類基因組中最常見的一種遺傳多態(tài), rs6265是位于BDNF基因的編碼外顯子, 是目前已知的BDNF基因的功能性多態(tài), 其G/A多態(tài)導(dǎo)致第66位氨基酸密碼子的改變, 使編碼氨基酸發(fā)生Val-Met(擷氨酸-蛋氨酸)的轉(zhuǎn)換, 并影響B(tài)DNF的分泌［5］。有報(bào)道, BDNF基因多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女的認(rèn)知功能障礙有關(guān)［6］。作者在本次研究中發(fā)現(xiàn), SAD組和對照組中AA、AG及GG3種基因型頻率和A、G等位基因頻率雖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 但SAD組患者的血清BDNF水平顯著低于比對照組患者。同時(shí), 將SAD組患者按基因型進(jìn)行分組分析也發(fā)現(xiàn), AA基因型患者的瞬時(shí)記憶力、注意力計(jì)算力及短時(shí)記憶得分顯著低于AG和GG基因型患者的, 而在定向力、語言能力、視空間覺和畫鐘試驗(yàn)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上研究結(jié)果說明了AA基因型的患者在記憶力方面的障礙重于其它的認(rèn)知功能, 與李娜等［7］的報(bào)道相似, 他們認(rèn)為, BDNFMet等位基因可能參與了患者的抽象思維能力以及記憶過程。這可能與受Met轉(zhuǎn)染的海馬神經(jīng)元存在活性依賴的BDNF分泌減少［8］, 可能導(dǎo)致了海馬膽堿能系統(tǒng)逆行性運(yùn)輸減少, 造成與SAD相關(guān)的基底前腦膽堿能神經(jīng)元進(jìn)行性凋亡及海馬神經(jīng)元變性從而導(dǎo)致了SAD認(rèn)知功能障礙。

綜上所述, BDNF基因的功能性多態(tài)-rs6265影響了BDNF的表達(dá), 從而引起了SAD的認(rèn)知功能。因此, 如何利用外源性BDNF來預(yù)防和改善SAD的認(rèn)知功能, 將是以后研究的熱點(diǎn)。

［1］ Mattson MP, Maudsley S, Martin B.BDNF and 5-HT:a dynamic duo in age-related neuronal plasticity and neurode-generative disorders.Trends Neurosci, 2004, 27(10):589-594.

［2］ McKhann G, Draehman D, Folstein M, et al.Clinical diagnosis of Alzheimer’s disease Report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer’s disease.Neurology , 1984, 34(7):939.

［3］ 李舜偉.認(rèn)知功能障礙的診斷與治療.中華神經(jīng)精神疾病雜志, 2006, 32(2):189-191.

［4］ Hu Y, Russek SJ.BDNF and the diseased nervous system:a delicate balance between adaptive and pathological processes of gene regulation.J Neurochem, 2008, 105(1):1-17.

［5］ Egan MF, Kojinma M, Callicott JH, et al.The BDNF val66met polymorphism affects activity-dependent secretion of BDNF and human memory and hippocampal function.Cell, 2003, 112(2):257-269.

［6］ 周華東, 唐明山, 鄧娟, 等.BDNF基因多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女認(rèn)知功能障礙關(guān)系的研究.重慶醫(yī)學(xué), 2008, 37(2):126-128.

［7］ 李娜, 高成閣, 陳策, 等.BDNF基因多態(tài)性與抑郁癥及認(rèn)知功能的關(guān)聯(lián)研究.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2012, 33(6):754-759.

［8］ Egan MF, KojimaM, Callicott JH, et al.The BDNF Va166Met polymorphism affects activity-dependent secretion of BDNF and human memory and hippocampal function.Cell, 2003, 112(2):257-269.

Correlation study between functional polymorphism of BDNF rs6265 and sporadic Alzheimer's disease

LI Jia-xin, ZHAI Jian-yu, LI Jian, et al. Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China

Objective To explore the relationship between functional polymorphism of BDNF(brainderived neurotrophic factor) rs6265 and sporadic Alzheimer’s disease(SAD).Methods Selecting 58 cases of SAD(SAD group) and 52 health old person(control group) as research subjects.Then the genotyped was detected via polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism and serum levels of BDNF detected by Enzyme-linked Immunosorbent Assay in all cases.Results There was significantly difference in the distributions of alleles(χ2=6.0595, P=0.013) and genotypes(χ2=6.0826, P=0.0478) between the case of SAD group and control group ,and the serum levels of BDNF were lowest for case of AA genotypes in SAD[(14.32±4.21) ng/ml, F=7.2545, P=0.0016].Conclusion The functional polymorphism of BDNF gene(rs6265) correlated with pathogenesis of SAD and affects the expression of BDNF in serum.

Brain-derived neurotrophic factor; Alzheimer’s disease; Functional polymorphism

2014-03-18］

廣西科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：桂科青0991036)

530021 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

韋斌垣