附子及附子、干姜配伍對H2O2導致心肌細胞損傷的抗氧化作用*

耿 姍 葛華雯 王新宇 梁 濤

（南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023）

·研究報告·

附子及附子、干姜配伍對H2O2導致心肌細胞損傷的抗氧化作用*

耿 姍 葛華雯 王新宇 梁 濤△

（南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023）

目的 觀察附子及附子、干姜配伍對H2O2誘導的乳鼠心肌細胞抗氧化作用。方法 取1～3 d乳鼠的心肌細胞，常規培養，觀察心肌細胞形態學，以免疫組化進行心肌細胞純度鑒定。實驗分為對照組、模型組、附子水煎液組20 mg/mL，附子干姜水煎液組20 mg/mL，預處理2 h后，用1 mmol/L H2O2氧化損傷2 h，檢測培養液中心肌細胞跳動頻率，丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）活性。結果 與模型組相比，用附子水煎液和附子干姜水煎液預處理后的心肌細胞跳動頻率增加 （P＜0.01），附子干姜水煎液組SOD活性明顯提高 （P＜ 0.01）。結論 附子干姜水煎液對H2O2誘導的心肌細胞損傷具有一定的保護作用。

心肌細胞 附子 干姜 丙二醛 超氧化物歧化酶

中藥的藥性是中藥理論的核心，也是中醫理論指導下使用藥物的依據。附子與干姜同屬辛熱，兩者辛熱同施，是熱熱配伍的典型代表［1］。干姜附子湯由干姜、附子配伍組成，方中附子辛熱有毒，為純陽之品，具有回陽救逆助陽補火散寒止痛的功效，多用于亡陽虛脫肢冷脈微等陽虛或亡陽的患者；干姜辛熱無毒，具有溫中散寒回陽通脈溫肺化飲的功效。已有文獻報道，姜附湯對阿霉素心臟毒性具有一定保護作用，其機制可能與抗氧化作用有關，同時也有研究認為，姜附湯的化學成分研究提示，干姜與附子均含有抗氧化成分［2-3］，本實驗通過細胞水平，采用H2O2誘導心肌細胞損傷，觀察附子水煎液和附子、干姜水煎液抗氧化應激的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 日齡1～3 d的SD乳鼠，清潔級，雌雄不限，動物合格證號SCXK（滬）：2007-0005，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。

1.2 試藥與儀器 附子（黑順片）、干姜原藥材購于南京解放軍第454醫院藥劑科。DMEM培養基：Gibco。胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司。一抗（α-Sarcomeric actin）：南京建成生物工程研究所。膠原酶Ⅰ型：Sigma；5-溴脫氧尿嘧啶：Sigma。胰蛋白酶：Sigma。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測試試劑盒：南京建成生物工程研究所。IX51倒置相差顯微鏡，日本Olympus產品。孵箱：上海精宏實驗設備有限公司。烤箱：上海圣欣科學儀器有限公司101AS-3。SyneRgy HT酶標儀：美國Bio-Tek。

1.3 心肌細胞的原代培養 參考文獻［4］改良，取SD大鼠無菌開胸，暴露心臟，于心臟收縮期剪下心臟，放于預冷的盛有1%雙抗的Hank’s液的培養皿中，清洗后移至培養皿中，將心尖剪為1 mm3碎塊，加入0.1%Ⅰ型膠原酶和0.06%胰蛋白酶的混合酶4 mL，消化10 min，反復消化2～3次，每次30 min，至組織消化成半透明狀時終止消化，200目細胞篩過濾至預冷的完全培養基，1000 r/min離心10 min，加20%DMEM吹勻。細胞懸液放CO2培養箱差速培養60 min去除成纖維細胞，2 d后第1次換液，培養前3 d加入0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶抑制成纖維細胞生長。

1.4 心肌細胞的免疫組化鑒定 將爬有細胞的蓋玻片用PBS洗2遍，然后加入4%的多聚甲醛固定1～5 h。將固定好的細胞爬片加幾滴PBS覆蓋15 min，然后用PBS洗3遍。在爬片上加1%的triton-100，室溫放置15 min。PBS浸泡5 min，清洗3次，加滅活酶，洗滌，加入一抗（α-Sarco-meric actin，α-SCA）100 μL，37℃，濕盒孵育2 h，洗滌，加入 HRP標記二抗 50 μL，室溫37℃，孵育30 min，洗滌，DAB法顯色。在光學顯微鏡下觀察、拍照。陽性結果判斷：以細胞內出現棕褐色為陽性，非心肌細胞不著色為陰性。

1.5 附子和附子干姜湯對H2O2誘導的乳鼠心肌細胞損傷的氧化作用 將處理好的心肌細胞分為對照組和模型組。對照組：以含10%胎牛血清DMEM培養細胞；模型組：在培養基中加入終濃度為1 mmol/L的H2O2孵育2 h；附子水煎液組：培養后，加入20 mg/mL附子水煎液預處理2 h，再在培養基中加入終濃度為1 mmol/L的H2O2孵育2 h；附子干姜水煎液組：培養后，加入20 mg/mL附子干姜水煎液預處理2 h，再在培養基中加入終濃度為1 mmol/L的H2O2孵育2 h。

1.6 指標檢測 （1）心肌細胞形態學觀察：培養48 h后，在倒置顯微鏡下觀察心肌細胞形態、生長狀態、搏動頻率，以判斷心肌細胞生長狀況是否良好。（2）心肌細胞免疫組化鑒定：判斷是否是心肌細胞以及陽性表達率。（3）對H2O2誘導的乳鼠心肌細胞損傷的檢測：①不同處理后的心肌細胞，顯微鏡下觀察并計數心肌細胞的搏動頻率。②酶標儀檢測細胞培養上清液MDA水平與SOD活性，嚴格按照試劑盒說明書的步驟操作。

1.7 統計學處理 運用SPSS15.0統計軟件。計量資料以（s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 心肌細胞形態學觀察 由倒置相差光學顯微鏡下可見，剛接種的心肌細胞懸浮于培養液中，培養4～ 6 h后，細胞開始貼壁生長；培養24 h后，部分細胞逐漸變為梭形或多邊形，逐漸在瓶壁表面鋪展；培養48 h后，細胞在瓶壁鋪展狀況更加明顯，形成不規則的星形，并伸出偽足，部分細胞開始搏動。培養72 h后，部分細胞交織成網，形成一片，單個細胞或片狀細胞自律搏動，搏動節律、強度穩定。見圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡下乳鼠心肌細胞的形態

2.2 心肌細胞免疫組化鑒定 見圖2。經免疫組化鑒定，在光學顯微鏡下觀察、拍照。陽性結果判斷：以細胞內出現棕褐色為陽性，非心肌細胞不著色為陰性，心肌細胞陽性率達95%以上，提示心肌細胞純度較理想。

圖2 α-SCA陽性心肌細胞（100倍）

2.3 附子和附子干姜湯對H2O2損傷心肌細胞跳動頻率、SOD及MDA的影響 見表1。由表1可知，模型組MDA值顯著高于對照組（P＜0.01），而跳動頻率和SOD值顯著低于對照組（P＜0.01），附子干姜水煎液可減少H2O2損傷后跳動頻率下降，使細胞內SOD含量增加，與模型組相比差異明顯（P＜0.01），但在降低MDA含量方面，僅有下降趨勢。附子水煎液可明顯增加H2O2損傷后跳動頻率，但對MDA和SOD影響不大。

表1 各組H2O2損傷心肌細胞跳動頻率和SOD、MDA水平比較（s）

表1 各組H2O2損傷心肌細胞跳動頻率和SOD、MDA水平比較（s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.01。

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3 討 論

在出生1～3 d的新生大鼠，心肌細胞具有部分增殖能力［4］，在乳鼠心肌細胞培養過程中，消化酶及其濃度的選擇很重要，有用Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶的混合酶或Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶的混合酶作為消化酶［5-6］。由于胰蛋白酶能分解組織間的蛋白，且對細胞膜有較強破壞作用，膠原酶作用比較溫和，但難以消化完全，需要時間較長［7］。本實驗采用0.1%Ⅰ型膠原酶和0.06%胰蛋白酶的混合酶分步消化，以減輕胰蛋白酶或膠原酶對心肌細胞的損傷。本實驗通過差速貼壁60 min，可去除大量成纖維細胞，加入終濃度為0.1 mmol/L的Brdu來抑制成纖維細胞的DNA和蛋白質的合成，從而達到純化心肌細胞的目的，通過免疫組化鑒定，心肌細胞陽性率達95%以上。

目前已有文獻報道，干姜與附子具有抑制心肌氧化反應和超氧陰離子自由基產生的作用［8］。MDA是脂質過氧化應激反應的終產物，SOD是機體內重要的抗氧化應激酶。本實驗結果顯示，附子及附子干姜水煎液組具有增加心肌細胞跳動頻率，強心作用；在氧化應激方面，附子干姜水煎液組提高SOD活性明顯優于附子組，附子單用在提高SOD活性方面不明顯；但在降低MDA活性方面，附子水煎液及附子干姜水煎液均作用不明顯，僅有下降趨勢，目前原因并不清楚，附子干姜抗氧化應激深入機制有待于今后進一步研究。

［1］ 黃穎，武乾，石曉路，等.附子、干姜配伍機制現代研究概述［J］.中華中醫藥學刊，2013，31（9）：1884.

［2］ 柳乃奎，黃雪松．脫氫姜酮、姜酚肟對兩種自由基的清除作用［J］．食品科學，2004，25（6）：72．

［3］ 劉古鋒，吳偉康，段新芬，等．附子多糖對力竭運動小鼠心肌過氧化損傷的保護作用［J］.海南醫學，2008，9（7）：68-69．

［4］ 孟云輝，李永新，于慧卿，等.新生SD大鼠心肌細胞的原代培養［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2014，12（1）：78-79.

［5］ 王佳南，張曉剛，湯為學，等.新生大鼠心肌細胞原代培養方法的改良［J］.重慶醫科大學學報，2009，34（5）：600-603.

［6］ 張乃菊，陳天平，祝曉光.乳鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞的原代培養［J］.蚌埠醫學院學報，2010，35（6）：558-561.

［7］ 郭舜，張樹江，段蕊，等.新生SD大鼠心肌細胞原代培養方法改進［J］.中藥藥理與臨床，2012，28（6）：139-141.

［8］ 吳偉康，羅漢.四逆湯清除氧自由基及抑制心肌脂質過氧化反應的體外實驗［J］．中國中藥雜志，1995，11（20）：701-702.

Antioxidant Effect of Aconite and Compatibility of Aconite dried and Ginger on Neonatal Rats'Myocardial Cells induced by H2O2

GENG Shan，GE Huawen，WANG Xinyu，et al. Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210023，China

Objective：To investigate the antioxidant effect of aconite and compatibility of aconite dried ginger pretreatment on neonatal rat myocardial cells induced by H2O2.Methods：Myocardial cells were clipped from 1～3 days of neonatal rat.Cell morphologic change was observed under an inverted microscope and purity identification of myocardial cells were studied by immunohistochemistry.Different groups were set after conventional cultur，such as normal groups，the model groups，20 mg/kg aconite decoction groups，20 mg/kg aconite and dried ginger decoction.After pretreatment 2 hours and the 1 mmol/L H2O2oxidative injury 2 hours.The different groups were observed about cell pulsating.The activity of MDA and SOD was detected.Results：Compared with model groups，in the aconite and dried ginger decoction pretreatment group，the beating rate of the myocardial cell was increased（P＜0.01）.The SOD activity were also improved（P＜0.01）.Conclusion：It has the protective effect of the aconite and dried ginger decoction on myocardial injury induced by the H2O2.

Myocardial cells；Aconite；Dried ginger；MDA；SOD

R285.5

A

1004-745X（2014）11-2012-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.019

2014-07-23）

南京中醫藥大學國家自然基金預研基金（12XYY08）

△通信作者