補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合脂肪來(lái)源干細(xì)胞移植對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能的影響*

羅 琳 周賽男 佘 顏 雷久士 張 熙

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

·研究報(bào)告·

補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合脂肪來(lái)源干細(xì)胞移植對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能的影響*

羅 琳 周賽男 佘 顏 雷久士 張 熙△

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合脂肪來(lái)源干細(xì)胞（ADSCs）移植對(duì)腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。方法 采用線栓法制備大鼠腦缺血模型，大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、ADSCs移植組（移植組）、補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合ADSCs移植組（聯(lián)合組）。各組又分7、14、21 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的亞組，觀察各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死面積及腦組織病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 與模型組比較，移植組、聯(lián)合組大鼠造模后14、21 d神經(jīng)功能評(píng)分均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且聯(lián)合組大鼠21 d神經(jīng)功能評(píng)分明顯優(yōu)于移植組（P<0.05）；各時(shí)間點(diǎn)移植組與聯(lián)合組大鼠腦梗死面積明顯小于同時(shí)相的模型組（P<0.01），且14、21 d聯(lián)合組優(yōu)于移植組（P<0.05）；造模后HE染色顯示模型組大鼠腦組織缺血周邊神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞明顯水腫，治療后腦組織損傷明顯減輕，聯(lián)合組的病理?yè)p傷最輕。結(jié)論 補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合ADSCs移植能減輕腦缺血后神經(jīng)功能損傷，具有腦保護(hù)作用。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯 脂肪來(lái)源干細(xì)胞 腦缺血 神經(jīng)功能

缺血性腦血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，且有很高的致殘率，3/4幸存者常出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。脂肪來(lái)源的干細(xì)胞（ADSCs）是一類來(lái)源于脂肪組織基質(zhì)的、具有增殖能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞［1］。目前國(guó)內(nèi)外一些研究均表明脂肪干細(xì)胞可作為有效的神經(jīng)組織工程種子細(xì)胞［2］，但由于干細(xì)胞向缺血區(qū)遷移能力以及存活率較低，其神經(jīng)再生效果并不理想［3］。如何高效誘導(dǎo)其分化為治療部位的功能細(xì)胞及促進(jìn)其與宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成是干細(xì)胞移植的研究重點(diǎn)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是中醫(yī)治療腦缺血的經(jīng)典名方，此方在臨床上廣泛應(yīng)用且療效確切。本研究通過(guò)ADSCs移植于腦缺血模型大鼠，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合ADSCs移植對(duì)缺血性大鼠模型神經(jīng)功能的保護(hù)作用，旨在為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量270～300 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。

1.2 主要試劑 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組方：黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，紅花3 g，桃仁3 g，地龍3 g，均購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，按標(biāo)準(zhǔn)方法2次煎煮后，每毫升含生藥2 g，冷藏備用。水合氯醛、多聚甲醛購(gòu)于北京鼎國(guó)生物公司，TTC（紅四氮唑購(gòu)于Sigma公司）。Ⅰ型膠原酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、2.5 g/L胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco公司。

1.3 造模與分組 參照Z(yǔ)ea-Longa文獻(xiàn)［4］制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）大鼠模型，假手術(shù)組除不插入線栓，其余相同。參照Longa及Bederson［4-5］的5分制法對(duì)術(shù)后清醒大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，剔除1～3分以外者。動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、ADSCs移植組（簡(jiǎn)稱移植組）、補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合ADSCs移植組（簡(jiǎn)稱聯(lián)合組）。各組再分7、14、21 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞提取、培養(yǎng)及移植取質(zhì)量80～100 g健康雄性SD大鼠，用100 mL/L的水合氯醛腹腔麻醉，無(wú)菌操作下分離大鼠腹股溝處脂肪，用手術(shù)剪將脂肪組織剪成碎塊，隨后加入2 mL 0.75 g/LⅠ型膠原酶置于37℃恒溫水浴箱消化，而后加入同體積DMEM液＋100 mL/L胎牛血清（FBS）培養(yǎng)液中和消化液，200目濾器過(guò)濾，離心，去除上清后制成單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液，以后每隔3 d換液1次，等細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，取3或4代的細(xì)胞用于移植，移植細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×106，以PBS稀釋為30 μL的細(xì)胞懸液，在腦立體定位儀下，經(jīng)側(cè)腦室注入［6］。聯(lián)合組大鼠于術(shù)后清醒起給予14.2 g／kg補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥液 （按體表面積60 kg成人用量的3倍換算），每日1次，分別給予7、14、21 d。余下各組動(dòng)物給予等體積的生理鹽水。

1.5 指標(biāo)檢測(cè) （1）神經(jīng)功能評(píng)分。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取10只大鼠，分別于MCAO術(shù)后第7、14、21日對(duì)各組大鼠采用修訂的神經(jīng)功能評(píng)分（mNSS）方法［7］進(jìn)行評(píng)價(jià)，總分為0～18分，分值越大表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，正常大鼠則為0分。（2）腦梗死面積測(cè)定。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取5只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取大腦后迅速放置-20℃冰箱冷凍20 min，快速冠狀切片6片（2 mm厚），避光狀態(tài)下用2%的紅四氮唑（TTC）液染色30 min，最后置于4%多聚甲醛中固定后拍照。應(yīng)用Image Tool 3.0圖象分析軟件計(jì)算梗死面積。按Swanson方法消除梗死側(cè)大腦半球因腦水腫造成的誤差，梗死面積百分比 （IS）＝（S1-Sr）/2S1× 100%（S1：健側(cè)總面積；Sr：患側(cè)非梗死區(qū)面積）。（3）HE染色觀察腦組織病理學(xué)變化。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5只大鼠，同腦梗死面積測(cè)定取大腦后用上述固定液固定24 h，常規(guī)脫水、包埋、冠狀連續(xù)切片（5 μm厚），HE染色后觀察各組大鼠腦組織缺血周邊區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（s）表示，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能mNSS評(píng)分檢測(cè) 見表1。假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分正常；其余各組大鼠造模后均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損，其分值隨著缺血的時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減少；移植組移植后7 d神經(jīng)功能mNSS評(píng)分與模型組比較差異均無(wú)顯著性（P＞0.05），但14、21 d其mNSS評(píng)分均顯著低于模型組（P＜0.05）；而聯(lián)合組則在7、14、21 d的mNSS評(píng)分顯著優(yōu)于模型組 （P＜0.05）；造模后，與移植組相比，聯(lián)合組14 d的mNSS評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），而聯(lián)合組21 d的mNSS評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能mNSS評(píng)分比較（分，s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能mNSS評(píng)分比較（分，s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與移植組比較，△P＜0.05。下同。

組別n 21 d 7 d 14 d假手術(shù)組10 0模型組 10 8.42±1.58移植組 10 6.88±1.45*0 0 10.65±1.68 9.58±1.66 9.93±1.60 8.13±1.38*聯(lián)合組 10 5.36±1.15**△9.25±1.44*7.35±1.24*

2.2 腦梗死面積測(cè)定 見表2。通過(guò)TTC染色計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦梗死面積，假手術(shù)組未見梗死灶形成，著比較均勻深紅色；余下各組局部梗死灶區(qū)顯示白色，位于缺血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬周圍，與模型組比較，移植組和聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)的腦梗死面積明顯縮小（P＜0.01）；而移植組與聯(lián)合組相比，14 d和21 d聯(lián)合組大鼠腦梗死面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 大鼠腦梗死面積百分比結(jié)果（%，s）

表2 大鼠腦梗死面積百分比結(jié)果（%，s）

組別n 21 d 7 d 14 d假手術(shù)組5 0模型組 5 22.66±2.22移植組 5 10.48±1.01**0 0 28.58±2.02 26.42±1.08 20.50±2.05**13.44±2.11**聯(lián)合組 5 7.75±1.98**△18.81±1.93**10.26±1.59**△

2.3 腦組織缺血周邊區(qū)病理變化 見圖1。光鏡觀察HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞胞體完整、形態(tài)正常，細(xì)胞核著色均勻、可見清晰核仁，無(wú)神經(jīng)細(xì)胞的損傷、水腫等改變。模型組造模后7 d缺血周邊區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分神經(jīng)細(xì)胞胞體縮小、輪廓不清，胞核固縮深染、碎裂溶解，腦組織明顯水腫，纖細(xì)胞及其毛細(xì)血管周圍間隙明顯增大；14、21 d神經(jīng)細(xì)胞水腫逐漸減輕、壞死逐漸減少。各時(shí)間點(diǎn)大鼠的損傷程度比較，移植組和聯(lián)合組較模型組明顯減輕，且聯(lián)合組的病理?yè)p傷最輕。

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織細(xì)胞形態(tài)變化（HE染色，400倍）

3 討 論

近年來(lái)，ADSCs由于增殖速度快，易于體外擴(kuò)增和純化，且其來(lái)源廣泛，還可以通過(guò)自體取材，從而避免了免疫排斥問(wèn)題，已經(jīng)成為干細(xì)胞治療腦缺血疾病研究的熱點(diǎn)。有實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腦缺血大鼠側(cè)腦室注射ADSC的方法，可以改善大鼠神經(jīng)功能的缺損癥狀［8］。但也有研究認(rèn)為由于腦缺血區(qū)炎癥反應(yīng)、血液循環(huán)障礙等因素，干擾了移植干細(xì)胞生存的內(nèi)環(huán)境，最終影響到干細(xì)胞在腦組織的遷移、存活、分化及再生能力［9］。中醫(yī)從整體觀念和辨證論治角度治療疾病，中醫(yī)藥通過(guò)對(duì)干細(xì)胞移植后存活、誘導(dǎo)分化方面發(fā)揮其多靶點(diǎn)、多效應(yīng)作用，一些研究將干細(xì)胞移植與中藥干預(yù)相結(jié)合，起到協(xié)同增效、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的功效［10］。

缺血性腦血管疾病屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇，而氣虛和血瘀是中風(fēng)病病因病機(jī)中的關(guān)鍵證候因素。具有益氣活血功效的補(bǔ)陽(yáng)還五湯是中醫(yī)治療中風(fēng)的經(jīng)典名方，臨床上治療腦缺血及其后遺癥均療效確切。一些實(shí)驗(yàn)室研究也表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯能促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移和分化，并且能促進(jìn)移植的干細(xì)胞存活，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)［11-12］。因此，本實(shí)驗(yàn)將補(bǔ)陽(yáng)還五湯和ADSCs移植聯(lián)合治療腦缺血大鼠模型。實(shí)驗(yàn)研究顯示，聯(lián)合組與移植組均可以減少腦缺血神經(jīng)功能評(píng)分、縮小腦梗死面積、改善缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，對(duì)局灶性腦缺血損傷有保護(hù)作用，且聯(lián)合組的療效顯著優(yōu)于單純移植組。其機(jī)制可能是在腦缺血的急性期起到了腦保護(hù)作用，抑制了大量神經(jīng)元凋亡與死亡，促進(jìn)缺血后腦組織再生修復(fù)代償，明顯改善了神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腦缺血損傷后組織修復(fù)，解決了腦缺血損傷的核心問(wèn)題——神經(jīng)元損傷引起的神經(jīng)功能障礙。

綜述所述，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合脂肪干細(xì)胞具有協(xié)同增效的作用，為中藥復(fù)方聯(lián)合干細(xì)胞移植治療腦缺血疾病的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其相互影響發(fā)揮作用的確切機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究，同時(shí)對(duì)于干細(xì)胞移植的安全性和遠(yuǎn)期療效等問(wèn)題還需進(jìn)一步的研究完善。

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Effect of Buyanghuanwu Decoction Combined with Adipose-derived Stem Cells Transplantation on Nerve Function in Experimental Rats with Cerebral Ischemia

LUO Lin，ZHOU Sainan，SHE Yan，et al. Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China

Objective：To explore the protective effects of Buyanghuanwu Decoction combined with adipose-derived stem cells（ADSCs）transplantation on cerebral ischemia in rat.Methods：Rats were randomly divided into the sham operation group，the model group，the ADSC transplantation group，the Buyanghuanwu Decoction combined with ADSCs group.Cerebral ischemia animal models were established with nylon thread.Each group was divided into 3 sub-groups according to 3 time points including the 7 d，the 14 d and the 21 d.Some indicators were observed in each group at different time points such as neurological function，cerebral infarction size and brain issue morphological changes.Results：Compared with model group，the neurological score were significantly decrease in transplantation group and combination group at 14 d and 21 d after MCAO（P<0.05 or P<0.01）.This index in the combination group was better than that in the transplantation group at 21 d（P<0.05）.The infarction area in transplantation group and combination group were significantly decreased compared with model group at the same time-phase.The size in the combination group was better than that in the transplantation group at 14 d and 21 d（P<0.05）.After MCAO，HE staining showed injuried never cells with twisted axonal processes and cells loss were evident in the ischemia penumbra，and those changes were very few in each treatment group especially the combination group.Conclusion：Buyanghuanwu Decoction combined with ADSCs transplantation can improve cerebral ischemic injury neurological recovery.It has cerebral protective effect．

Buyanghuanwu Decoction；Adipose-derived stem cells；Cerebral ischemia；Nerve function

R285.5

A

1004-745X（2014）11-1994-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.012

2014-08-02）

湖南省教育廳科研項(xiàng)目（12C0269）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（病理學(xué)與病理生理學(xué)）

△通信作者