加味清營顆粒對脂多糖誘導大鼠急性肺損傷模型炎性因子的影響*

劉榮榮彭 敏馬宏博△

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250014；2.山東大學附屬省立醫院，山東 濟南 250014）

·研究報告·

加味清營顆粒對脂多糖誘導大鼠急性肺損傷模型炎性因子的影響*

劉榮榮1彭 敏2馬宏博2△

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250014；2.山東大學附屬省立醫院，山東 濟南 250014）

目的 觀察加味清營顆粒對急性肺損炎性因子的影響。方法 144只wistar大鼠隨機分為空白對照組，模型組，加味清營顆粒低、中、高劑量組，地塞米松組，每組24只，連續灌胃6 d，尾靜脈注射LPS（5 mg/kg）后于1，3，5 h不同時相處死大鼠。采用ELISA法檢測肺泡灌洗液（BALF）中炎癥介質白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-10的含量變化；用Bradford檢測BALF蛋白含量；HE染色觀察病理切片。結果 模型組各時相炎癥因子均明顯高于其他各組；與模型組比較，各治療組均可顯著降低的炎癥介質IL-1β、TNF-α、IL-10的表達（P<0.05）；與地塞米松組比較，加味清營顆粒低、中、高劑量組在1 h、3 h時相降低IL-1β、TNF-α的表達有統計學意義（P<0.05）；與模型組相比較，各治療組均可顯著降低的BALF蛋白的表達（P<0.05）；與地塞米松組比較，加味清營顆粒各時相劑量組在降低BALF蛋白的表達方面有統計學意義（P<0.05）；肺組織HE染色病理結果示肺泡結構破壞或實變，肺泡隔增厚顯著，毛細血管充血明顯，肺泡腔內、細動脈周圍和細支氣管壁可見成堆炎癥細胞浸潤，而加味清營顆粒各劑量組肺組織病理均有較大程度的改善。結論 加味清營顆粒可降低急性肺損傷時炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-10的釋放，降低BALF中蛋白的含量，從而減輕肺部炎癥細胞浸潤，對損傷的肺組織起到修復保護的作用。

加味清營顆粒 急性肺損傷 炎癥介質

急性肺損傷是全身炎癥反應綜合征在肺部的表現，是嚴重創傷或感染后出現最早及發生率最高的并發癥之一。本實驗通過觀察加味清營顆粒對內毒素性肺損傷大鼠肺組織中炎癥介質白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-10表達的影響，及肺泡灌洗液（BALF）中蛋白的含量和肺組織病理切片變化，觀察其對內毒素性急性肺損傷的治療效果，指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 加味清營顆粒由水牛角、地黃、金銀花、連翹、玄參、黃連、麥冬、竹葉、丹參、西洋參、大黃組成，藥品采用三九醫藥生產的配方顆粒，購自于山東省立醫院中藥房。地塞米松注射液（鄭州卓峰制藥有限公司，每支5 mg，批號H41020055）；脂多糖（美國Sigma公司，O55：B5）。ELISA檢測試劑盒（Invitrogen）

1.2 動物 健康清潔級雄性wistar大鼠，體質量（250±20）g，由山東大學醫學院動物中心提供。

1.3 造模與分組 將144只大鼠隨機分為6組，空白對照組，模型對照組，加味清營顆粒低、中、高劑量組，地塞米松組，每組24只。適應性飼養1周后開始灌胃，空白對照組與模型對照組每日每次予生理鹽水2 mL灌胃，加味清營顆粒低、中、高劑量組每日分別給予

1.2 、1.8、2.4 g/100 g體質量，地塞米松組每日給2.5 mg/ 100 g體質量灌胃。灌胃6 d后，除空白對照組向大鼠尾靜脈靜推生理鹽水2.5 mL/kg外，其余各組向大鼠尾靜脈靜推內毒素5 mg/kg。后放回籠中自由活動及飲食，觀察各組呼吸變化情況。

1.4 標本采集與檢測 以上各組分別于注射LPS后 1、3、5 h，10%水合氯醛麻醉處死大鼠，開胸取肺，每次用2 mL生理鹽水灌洗左肺，共3次，合并3次收集到的BALF-20℃凍存待測。采用ELISA法檢測BALF中IL-1β、TNF-α、IL-10的變化；用考馬斯亮藍法（Bradford）檢測BALF中蛋白含量；取右肺上葉，制作石蠟切片，行HE染色，普通光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.5 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（s）表示，組間差異采用單因素方差分析和q檢驗，組內對比采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠BALF中IL-1β、TNF-α、IL-10的水平 見表1～3。結果顯示，與空白對照組相比，模型組BALF中IL-1β、TNF-α、IL-10含量明顯升高，具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組大鼠BALF中 IL-1β、TNF-α、IL-10水平均顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與地塞米松組比較，加味清營顆粒各組在1、3 h時相炎癥介質IL-1β、TNF-α、IL-10均顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），在5 h時相無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組BALF中IL-1β的含量變化（pg/mL，s）

表1 各組BALF中IL-1β的含量變化（pg/mL，s）

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與地塞米松組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。下同。

組別n 5 h空白對照組 8 17.49±0.16模型組 8 36.285±0.85**中藥低劑量組 8 30.54±2.02**△△1 h 3 h 18.12±0.22 19.68±1.03 35.86±0.21**37.93±3.55**27.17±1.19**△△29.06±1.78**△△中藥中劑量組 8 27.62±1.04**△△25.34±1.37**△△＃26.27±0.45**△△##中藥高劑量組 8 22.27±1.09**△△＃24.59±2.36**△△##25.97±1.64**△△地塞米松組 8 30.70±4.11**△28.09±0.82**△△28.44±3.47**△△

表2 各組BALF中TNF-α的含量變化（pg/mL，s）

表2 各組BALF中TNF-α的含量變化（pg/mL，s）

組別n 5 h空白對照組 8 162.98±33.71模型組 8 283.99±1.30**中藥低劑量組 8 221.46±19.42*△△1 h 3 h 143.22±5.29 166.31±29.75 296.06±6.37**292.63±5.35**219.48±5.77**△△##230.30±11.56**△△#中藥中劑量組 8 224.84±2.67*△△214.49±15.98**△△##220.11±8.59**△△##中藥高劑量組 8 209.28±19.16**△△##217.04±7.01*△△##229.99±30.67*△地塞米松組 8 261.20±13.07**△△248.84±7.03**△△224.84±4.60*△△

表3 各組BALF中IL-10的含量變化（pg/mL，s）

表3 各組BALF中IL-10的含量變化（pg/mL，s）

組別n 5 h空白對照組 8 30.47±0.59模型組 8 57.72±1.27**中藥低劑量組 8 53.09±4.49**△1 h 3 h 31.43±0.35 29.76±0.80 55.98±1.58**58.35±2.25**43.60±0.94**△△##48.94±4.42**△△中藥中劑量組 8 45.17±0.47**△△36.18±0.76**△△##46.07±5.48**△△中藥高劑量組 8 34.13±0.78**△△##41.85±2.88**△△47.60±5.66**△△地塞米松組 8 48.94±1.20**△△47.71±6.03**△△50.90±4.87**△

2.2 大鼠BALF中蛋白含量的變化 見表4。除空白對照組以外，各組的BALF蛋白水平均有升高；與模型組比較，各治療組蛋白含量均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；加味清營顆粒低、中劑量組蛋白升高值明顯低于地塞米松組，差異具有統計學意義 （P＜0.01），高劑量組與地塞米松組比較無明顯差異 （P＞0.05）。

2.3 病理形態學的變化 光鏡下見空白對照組肺泡結構完整，無水腫，肺泡隔未見增厚，偶可見少量炎癥細胞浸潤（見圖1～3）。模型組肺泡結構破壞或實變，肺泡隔增厚顯著，毛細血管充血明顯，肺泡腔內、細動脈周圍和細支氣管壁可見成堆炎癥細胞浸潤和大量紅細胞滲出，炎癥細胞主要以中性粒細胞、淋巴細胞為主，其中病理損傷以5 h最為明顯（見圖1～3）。各用藥組亦存在肺泡結構破壞或實變、肺泡隔增厚、毛細血管充血、肺泡腔內、細動脈周圍和細支氣管壁可見成堆炎癥細胞浸潤和紅細胞滲出情況，但均較模型組有較大程度的改善。光鏡下觀察加味清營顆粒各組炎癥變化均比地塞米松組炎癥輕。

表4 各組BALF中蛋白含量變化（μg/mL，s）

表4 各組BALF中蛋白含量變化（μg/mL，s）

組別n 5 h空白對照組 8 1.72±0.10模型組 8 14.28±1.59**中藥低劑量組 8 8.52±2.23**△△##1 h 3 h 1.03±0.35 1.45±0.08 8.90±1.57**11.69±1.16**5.07±1.22**△△##6.60±1.17**△△##中藥中劑量組 8 6.85±1.10**△△##4.38±0.65**△△##5.36±0.86**△△##中藥高劑量組 8 2.68±0.56**△△3.25±0.36**△△4.25±0.90**△△地塞米松組 8 2.61±0.43**△△3.35±0.46**△△3.63±0.44**△△

圖1 各組1 h時HE染色（100倍）

3 討 論

圖2 各組3 h時HE染色（100倍）

圖3 各組5 h時HE染色（100倍）

急性肺損傷是由感染、大面積肺栓塞、外傷等多種因素所致急性肺部損傷［1-2］。免疫反應失衡是引起危重患者死亡的重要因素，其中過度炎癥反應是危重癥患者機體免疫反應失衡的重要環節［3-4］。急性肺損傷發病的關鍵是致病因子激活多種炎癥細胞，釋放一系列炎癥介質，這些炎癥介質可再度激活炎癥細胞，以“自分泌”或“旁分泌”的方式釋放更多的炎癥介質或細胞因子，導致瀑布式的炎癥反應，形成肺過度損傷［5］。肺組織細胞中IL-1β、TNF-α的過量表達參與介導了急性肺損傷的發生［6］。其中IL-10是一種重要的抑制性細胞因子，對機體的免疫功能和炎癥過程具有重要的調節活性。研究發現，IL-10能通過廣泛抑制 IL-1β、TNF-α等炎癥介質的產生，參與體內內毒素介導的TNF-α負反饋調節［7-8］。

內毒素類似于中醫學的“熱毒”，其造成急性肺損傷的臨床表現類似于中醫的溫病。根據溫病衛氣營血辨證施治原則，大多數醫家選用清熱解毒、活血化瘀、通里攻下、益氣固脫法等方法治療急性肺損傷。筆者認為內毒素所致之急性肺損傷，乃邪熱內傳營分，耗傷營陰所致，遵《素問·至真要大論》“熱淫于內，治以咸寒，佐以甘苦”之旨，治宜咸寒清營解毒為主，輔以透熱養陰。清營湯出自于《溫病條辨》，是治療溫病熱入營血分的經典方。而加味清營顆粒系在清營湯基礎上加用大黃、西洋參。方中苦咸寒之水牛角清解營分之熱毒，為君藥。熱傷營陰，又以生地黃涼血滋陰、麥冬清熱養陰生津、玄參滋陰降火解毒，諸藥共用，既可甘寒養陰保津，又可助君藥清營涼血解毒，共為臣藥。君臣相配，咸寒與甘寒并用，清營熱而滋營陰，祛邪扶正兼顧。溫邪初入營分，故用銀花、連翹、竹葉清熱解毒，輕清透泄，使營分熱邪有外達之機，促其透出氣分而解，此即“入營猶可透熱轉氣”之具體應用；黃連苦寒，清心解毒；丹參清熱涼血，并能活血散瘀，可防熱與血結；由于熱病傷陰，配伍西洋參能夠清熱養陰，益氣生津，現代藥理研究表明西洋參具有提高機體免疫力，抗缺氧，能夠降低血液凝固性、抑制血小板凝聚等作用；大黃清熱瀉火，涼血解毒，現代藥理研究表明，大黃具有抗炎、解熱、抑制非特異性免疫功能等作用。上述7味均為佐藥。本方的配伍特點是以清營解毒為主，配以養陰生津和“透熱轉氣”，使入營之邪透出氣分而解，諸癥自愈。既往研究表明西洋參、大黃組成的扶正排毒液［9］對內毒素休克肺損傷具有保護作用，二者可抑制TNF-α和IL-10的過度分泌，調整感染狀態下的免疫紊亂、炎癥與抗炎失衡，降低重要臟器的損害。

本研究通過尾靜脈注射脂多糖制作大鼠內毒素急性肺損傷模型，觀測不同時間點BALF中炎癥因子的變化。從實驗結果可以看出，各用藥組均能夠顯著降低炎癥介質IL-1β、TNF-α、IL-10的釋放，提示加味清營顆粒可抑制IL-1β、TNF-α等炎癥介質的產生，其中5 h以內加味清營顆粒高劑量組效果尤為明顯；病理切片顯示在各時間段加味清營顆粒均可有效控制炎癥反應。由上所述，可以看出加味清營顆粒可減輕炎癥的“級聯式”反應，進而減輕肺組織損傷，阻止炎癥的發生、發展，對肺組織有保護作用。其具體的抗炎保護機制有待進一步研究。

［1］ Blank R，Napolitano LM.Epidemiology of ARDS and ALI［J］. Crit Care Clin，2011，27（3）：439-435.

［2］ Vadasz I，Sznajder JI.Update in acute lung injury and critical care 2010［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，183（9）：1147-1152.

［3］ de Gonzalo-Calvo D，Neitzert K，Fernandez M，et al.Differential inflammatory responses in aging and disease：TNF-alpha and IL-6 as possible biomarkees［J］.Free Radio Biol Med，2010，49（5）：733-738.

［4］ Calder PC.The 2008 ESPEN sir david cuthbertson lecture：fatty acids and inflammatory from the membrane to the nucleus and the laboratory bench to the clinic［J］.Clin Nutr，2010，29（1）：5-12.

［5］ 李玉梅，衛洪昌．ALI／ARDS抗炎治療研究的策略與展望［J］．中國病理生理雜志，2009，25（4）：813-816．

［6］ Abraham E.NF-Kappa B activation［J］.Crit Care Med，2000，28（4 Suppl）：100-104.

［7］ Ward PA，Lentsch AB.Endogenous regulation of the acute inflammatory response［J］.Mol Cell Biochem，2002，234-235（1-2）：225-228.

［8］ Chen ZT，Li SL，Cai EQ，et al.LPS induces puimonary intravascular macrophages producing inflammatory mediators via activating NF-kappaB［J］.J Cell Biochem，2003，89（6）：1206-1214.

［9］ 馬宏博，劉清泉，姜良鐸，等．扶正排毒液對內毒素休克肺損傷家兔支氣管肺泡灌洗液和血清細胞因子含量的影響［J］．中國中西醫結合急救雜志，2005，12（6）：369-372.

Effects of Modified Qingying Granule on Inflammatory Mediator Induced by Lipopolysaccharide in Rat Model with Acute Lung Injury

LIU Rongrong1，PENG Min2，MA Hongbo2. 1 Shandong Traditional Chinese Medicine University，Shandong，Jinan 250014，China；2 Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Shandong，Jinan 250014，China

Objective：To investigate the effect of Modified Qingying Granule on inflammatory mediator of acute lung injury.Methods：144 Wistar rats were randomly divided into blank control group，model group，Modified Qingying Granule low dose group，medium dose group and high dose group，and dexamethasone group（n=24）. Continuous intragastric administration lasted 6 days.After tail vein injection of LPS（5 mg/kg），rats were executed at 1st，3rd，and 5th hour later.ELISA was used to detect the content changes of inflammatory mediators such as IL-1β，TNF-α and IL-10 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）.BALF protein was examined by Bradford.The pathological section was made into HE stainining.Results：Inflammatory cytokines at different time points of model group were significantly higher than those in the other groups.Compared with model group，expressions of inflammatory mediators of treatment groups decreased（P<0.05）.Compared with dexamethasone group，Modified Qingying Granule low，midium and high dose groups at 1 h and 3 th hour had statistical significance in reducing IL-1β and TNF-α expressions（P<0.05）.Compared with model group，expression of BALF protein in treatment groups significantly decreased（P<0.05）.Compared with dexamethasone group，Modified Qingying Granule had statistical significance in reducing BALF protein expression（P<0.05）.Lung tissue HE staining pathological results revealed damaged or changed alveolar structure，thickened alveolar septa，capillary congestion，and visible piles of inflammatory cell infiltration in alveolar space，around arteriole and in bronchiolar wall.Modified Qingying Granule groups had a greater degree of improvement in lung tissue pathology.Conclusion：Modified Qingying Granule can reduce the expressions of inflammatory mediators such as IL-1β and TNF-α，increase expression of IL-10，reduce the content of bronchoalveolar lavage fluid protein，so as to reduce the pulmonary inflammatory cellinfiltration and to repair the protective function of damaged lung tissue.

Modified Qingying Granule；Acute lung injury；Inflammatory mediator

R285.5

A

1004-745X（2014）11-1964-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.002

2014-08-14）

國家自然科學基金青年基金項目（81202675）；山東省自然科學基金青年基金項目（ZR2011HQ052）

△通信作者