USP22在結直腸癌中的活化狀態研究

姜爭 劉彥龍 王錫山

USP家族，即泛素化特異性蛋白酶家族，通過去除共軛復合物中的泛素，進而調節一系列的細胞機制，包括前植入、生長和分化、細胞周期進展、腫瘤形成、轉錄活性和信號轉導等[1-2]。該家族是目前已知的去泛素化酶中成員最多，且結構最具多樣性的一類。這些酶分子都含有兩個短而保守的片段即賴氨酸盒和組氨酸盒，序列中具有起催化作用的三聯殘基，即半胱氨酸、組氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺，能將泛素分子從大的蛋白上移除[3]。這些USP基因或為腫瘤抑制基因或為致癌基因來行使截然不同的生長調節功能。

USP22作為一種新型的去泛素化水解酶廣泛表達于各種成年組織中，中等表達于心臟和骨骼肌，弱表達于肺臟、肝臟和胚胎的早期[4]。通過聯合檢測USP22及11-Polycomb癌癥干細胞信號中的其它基因，可以預測腫瘤是否具有侵略性和耐藥性等特點，使癌癥患者的診斷和病情級別的劃分成為可能，并且發現癌細胞如表達這種信號則會獲得轉移促使-失巢凋亡抑制-非整倍體-異常細胞周期控制的干細胞樣表型。為了驗證這種觀點，我們在本文中詳細探討USP22在結直腸癌發生發展過程中的作用。

資料與方法

一、一般方法

選取哈爾濱醫科大學附屬二院2001至2003年手術切除的192例結直腸癌患者的存檔蠟塊作為實驗對象，包括正常粘膜27例、腺瘤27例、腺癌192例、肝轉移灶15例、淋巴結轉移灶22例。其中正常粘膜、腺瘤、腺癌均取自同一患者，轉移灶與原發灶相配對。對全部蠟塊重新切片，行HE染色，由兩位高年資病理醫師進行復查。同時收集研究病例的臨床病理資料。

二、實驗方法

抗USP22抗體(Ⅰ抗)購自Abcam公司，為濃縮型兔抗人單克隆抗體；抗Ki-67抗體(I抗)購自Santa Cruz公司，為濃縮型鼠抗人單克隆抗體；PV免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

(一)免疫組化方法

載玻片經1 ∶10稀釋的多聚賴氨酸涂片處理，4 μm石蠟連續切片。將石蠟組織切片以60℃烤60 min，常規脫蠟、水化。用新鮮配制的3% H2O2清除內源性過氧化氫酶。抗原修復，滴加4%BSA封閉非特異性抗原；將多余液體甩凈后滴加1:200稀釋的I抗，30℃溫箱中孵育2小時后置于4℃冰箱內過夜；30℃溫箱中復溫2 h。PBS沖洗后加羊抗兔、抗鼠二抗工作液，30℃溫箱孵育60 min；PBS洗后加三抗工作液，30℃溫箱中孵育60 min；DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精上行脫水、二甲苯透明。中性樹膠封片后鏡檢。本實驗采用PBS代替一抗做為抗體對照。

(二)免疫組化評定方法

USP22蛋白陽性產物主要定位于細胞核，表現為細胞核內有棕黃色或棕褐色顆粒。陰性對照為同一批次樣品，不加一抗。免疫組織化學染色結果判斷標準參照[5]如下的評分方法：光學顯微鏡下觀察組織標本的著色程度，高倍鏡下(10×40)隨機取4個不同視野，計數細胞總數及核陽性細胞數，按陽性細胞所占的百分比計分：0為陰性表達；1+為弱陽性，陽性細胞數為1～10%；2+為陽性細胞11～50%；3+為陽性細胞≥50%。以陽性細胞數≥10%定為USP22陽性表達。以上結果至少由2位病理科醫生在雙盲情況下觀察確定。

(三)統計學方法

應用SPSS13.0統計學軟件處理數據。USP22的表達量與結直腸癌臨床病理因素的關系，正常粘膜、腺瘤、腺癌及轉移灶中表達的比較分別應用卡方檢驗和t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、在結直腸癌發生過程中USP22的表達量逐步上調

USP22除表達于少量的炎性淋巴細胞外，主要表達于結直腸上皮細胞的細胞核中(圖1)。通過統計分析，USP22的表達量逐步升高，其中USP22在腺癌中的表達均明顯高于正常粘膜(P<0.0001)和腺瘤(P=0.006)，但USP22在正常粘膜與腺瘤的表達差異無統計學意義(P=0.192)

二、在結直腸癌轉移過程中USP22的表達量逐步上調

與原發灶比較，USP22在淋巴結轉移灶中的表達升高無差異(P=0.052)，在肝轉移灶中的表達則顯著升高(P=0.021，圖2)。

三、USP22的表達與臨床病理資料相關性分析結果

在192例原發灶中，104例(54.16%)呈陽性表達。USP22 的表達與患者的性別(χ2=4.642，P=0.031)、腫瘤大小(χ2=9.067，P=0.003)、浸潤深度(χ2=22.543，P<0.0001)、淋巴結狀態(χ2=8.066，P=0.005)及 Ki-67 的表達(χ2=37.829，P<0.0001)高度相關，而與患者的年齡、腫瘤部位無相關性(表1)。

注：a圖為USP22在細胞核中組織免疫化學染色圖像；b圖為USP22在淋巴細胞中組織免疫化學染色圖像

注：a圖為在結直腸癌轉移過程中USP22在原發灶中免疫組織化學染色圖像；b圖為在結直腸癌轉移過程中USP22在轉移灶中免疫組織化學染色圖像

表1 USP22表達與臨床病理因素相關性分析情況表

變量數量USP22陰性USP22陽性P值年齡(歲) <6010347560.952 ≥60894148性別 男11244680.031 女804436腫瘤部位 結腸7631450.301 直腸1165759腫瘤大小(cm) <57645310.003 ≥51164373浸潤深度 T1-31046440<0.0001 T4882464淋巴結受累程度 N011261510.005 N1-2802753Ki-67表達 陰性695217<0.0001 陽性1233687

討 論

USP22作為一種新型的去泛素化水解酶廣泛表達于各種成年組織，如中等表達于心臟、骨骼肌，弱表達于肺臟、肝臟和胚胎的早期[4]。通過聯合檢測USP22及11-Polycomb/癌癥干細胞信號中的其它基因，可以預測腫瘤是否具有侵略性和耐藥性等特點，使癌癥患者的診斷和病情級別的劃分成為可能，并且發現癌細胞如表達這種信號則會獲得轉移促使-失巢調亡抑制-非整倍體-異常細胞周期控制的干細胞樣表型。為了驗證這種觀點，我們重點論述了USP22在結直腸癌發生發展過程中及其在指導預后方面的作用。

我們通過免疫組化檢測USP22在粘膜、腺瘤、腺癌及其轉移灶中的表達情況，發現隨著結直腸癌的發生發展，USP22的表達量逐步升高。與粘膜和腺瘤相比，USP22在癌灶中的表達量最高，這說明致癌基因USP22的活化狀態會促進結直腸癌的發生發展。而且，與原發灶相比較，USP22在肝轉移灶中的表達顯著增高。這說明USP22的表達升高會促進結直腸癌的轉移，尤其是肝轉移，這也支持PcG通路的活化可能介導實體瘤轉移這一假設[6]。

通過本研究發現USP22與Ki-67的表達高度相關，這說明高表達USP22的腫瘤細胞其增殖能力強，這也同樣符合Polycomb/癌癥干細胞信號可以準確預測惡性腫瘤細胞的生長狀態的假設[7]，USP22編碼的蛋白是一種酶，容易受到藥物的影響，可能會成為抗腫瘤藥物的理想靶點。

[1] Baek KH.Conjugation and deconjugation of ubiquitin regulating the destiny of proteins.Exp Mol Med，2003，35(1):1-7.

[2] Kim JH,Park KC,Chung SS,et al.Deubiquitinating enzymes as cellular 135 regulators.J Biochem，2003，134(1):9-18.

[3] Pajor AM,Kahn ES,Gangula R.Role of cationic amino acids in the Na+/dicarboxylate co-transporter NaDC-1.Biochem J，2000，350(3):677-683.

[4] Lee HJ,Kim MS,Shin JM,et al.The expression patterns of deubiquitinating enzymes,USP22 and Usp22.Gene Expr Patterns，2006，6(3):277-284.

[5] Silva J,García JM,PeC,et al.Implication of olycomb members Bmi-1,Mel-18,and Hpc-2 in the regulation of 16INK4a,p14ARF,h-TERT,and c-Myc expression in primary breast arcinomas.Clin Cancer Res，2006，12(23):6929-6936.

[6] Berezovska OP.Essential role for activation of the Polycomb group PcG protein chromatin 145 silencing pathway in metastatic prostate cancer.Cell Cycle，2006，5(16):1886-1901.

[7] 黃甜,聶紹發,柳巍,等.大腸癌患者生存時間影響因素分析.中國公共衛生，2008，24(1):73-74.