犬瘟熱病毒SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法的建立

李菊梅

(青海省大通縣橋頭鎮新城畜牧獸醫站， 青海 大通 810100)

犬瘟熱病毒SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法的建立

李菊梅

(青海省大通縣橋頭鎮新城畜牧獸醫站， 青海 大通 810100)

為建立犬瘟熱病毒(CDV)SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法，采用RT-PCR擴增CDV F基因269 bp片段，并克隆入pMD18-T載體中，以純化的重組質粒為模板作熒光定量PCR擴增，建立了CDV熒光定量PCR檢測方法。該方法檢測靈敏度可達1.6×101拷貝/μL，與犬細小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠狀病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不發生交叉反應，具有很好的特異性和重復性。結果表明：建立的CDV實時熒光定量PCR具有特異、敏感、快速、定量、重復性好等優點，可用于臨床犬瘟熱(CD)的檢測。

犬瘟熱病毒；F基因；SYBR Green I；熒光定量PCR

犬瘟熱(Canin Disteroper，CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的犬科、鼬科、靈貓科及部分浣熊科動物的一種急性、亞急性、高度接觸性傳染病[1]，是當前對全世界養犬業、毛皮動物養殖業和野生動物保護業危害最大的疫病之一。CDV是負鏈單股不分節的RNA病毒，屬于副黏病毒科麻、疹病毒屬成員。CDV基因組全長15 690 bp，編碼6種結構蛋白，分別為核衣殼蛋白(N)、膜蛋白(M)、磷蛋白(P)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)、大蛋白(L)，其中融合蛋白(F)是CDV的主要的結構蛋白之一，在機體免疫原性與致病性上發揮著重要作用[2]。

快速檢測CDV是有效預防CD的前提，目前CD診斷方法有病毒的分離和鑒定[2]、間接免疫熒光 (IFA)[3]、膠體金檢測技術(GIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)[4]和RT-PCR[5]等，但上述各種方法均存在一定的缺陷，如GIA不能檢測出感染早期及亞臨床感染狀態下的CDV，ELISA無法鑒別自然感染與疫苗免疫動物，常規RT-PCR易污染、不易標準化，通量較低。……