黃芪桂枝五物湯中總黃酮對小鼠免疫功能影響的體外研究※

李樹義 趙志強 張慶波 邊洪榮 賈麗霞

(河北聯合大學基礎醫學院，河北 唐山 063000)

黃芪桂枝五物湯中總黃酮對小鼠免疫功能影響的體外研究※

李樹義 趙志強 張慶波△邊洪榮1賈麗霞

(河北聯合大學基礎醫學院，河北 唐山 063000)

目的探討黃芪桂枝五物湯中總黃酮對小鼠免疫功能的影響，從而為臨床應用提供參考。方法取小鼠脾淋巴細胞，加入不同濃度的總黃酮，采用水溶性四唑鹽(WST-1)法測定細胞的增殖活性；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測細胞因子白細胞介素-2(IL-2)和干擾素γ(IFN-γ)含量；流式細胞儀檢測小鼠脾細胞中CD3+、CD19+細胞。結果各濃度總黃酮組淋巴細胞增殖活性、IL-2、IFN-γ及CD3+細胞顯著高于對照組(P<0.05，P<0.01))。結論總黃酮可增強免疫功能，但只能提高細胞免疫功能，對體液免疫功能無明顯影響。

黃芪桂枝五物湯；免疫；干擾素Ⅱ型；白細胞介素2；動物實驗

黃芪桂枝五物湯載于《金匱要略·血痹虛勞病脈證治》，由黃芪、芍藥、桂枝、生姜、大棗5味藥組成，具益氣溫經、和營通脈之功[1]。原方主要是治療血痹，而現代臨床應用已遠遠超越了原方“血痹”的范疇，尤其是在治療類風濕關節炎、微循環障礙和中風后遺癥等方面，收到滿意的療效[2]。長期以來備受中醫學者青睞，是臨床常用經典

名方之一。

總黃酮是黃芪桂枝五物湯中的主要成分之一，具有多種重要的生物學作用，包括對免疫功能的影響，但總黃酮對機體免疫功能影響的系統研究，目前尚未見文獻報道。本研究通過小鼠脾細胞體外實驗，探討總黃酮對免疫功能的影響，為臨床應用和相關產品的開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 總黃酮：由河北聯合大學藥學院提供，提取方法參照文獻[3]。測增殖活性用試劑水溶性四唑鹽(WST)-1：購于江蘇碧云天生物科技公司。白細胞介素-2(IL-2)和干擾素γ(IFN-γ)檢測試劑盒：購于武漢博士德生物工程有限公司。全自動酶標儀SpectraPlus384：美國Molecular Devices公司生產。流式細胞儀：EPICS?ALTRATM型，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實驗動物 取4～6周齡昆明種小鼠，體質量(20±2)g，雌雄各半，SPF級，購于北京軍事醫學科學院，動物合格證號：0123883。

1.3 小鼠脾細胞增殖活性測定 取5周齡小鼠4只，雌雄各2只，頸椎脫臼處死，無菌分別取脾臟，細胞篩研磨成脾淋巴細胞懸液，加入1 mL蒸餾水破碎紅細胞，30 s后加入1.8% 氯化鈉溶液1 mL，離心去上清液，磷酸緩沖液(PBS)洗細胞3次，計細胞總數，調細胞濃度為1.0×106/mL。在96孔細胞培養板中，每孔加100 μL 細胞懸液，10 μL 不同濃度的總黃酮溶液(0.062 5、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL)作為實驗組，同時設不加總黃酮的對照組。每組設3個復孔，置二氧化碳(CO2)培養箱中分別培養3、6、9 d，用WST-1測光密度(OD)值，4只小鼠取均值。

1.4 小鼠IL-2、IFN-γ測定 上述細胞測定增殖前，取上清50 μL置于-80 ℃冰箱中保存備用。樣品收集完畢后，采用酶聯合免疫吸附法(ELISA)分別檢測IFN-γ、IL-2的含量(按酶聯免疫試劑盒說明書要求操作)。

1.5 細胞亞群分析 檢測小鼠脾細胞中CD3+細胞和CD19+細胞。取小鼠脾淋巴細胞懸液，以 5×106/mL 的濃度接種于24孔培養板中，每孔2.0 mL，實驗組加入0.5 mg/mL的總黃酮溶液0.1 mL，對照組加入0.1 mL RPMI-1640培養液，培養6 d后，取細胞懸液，1 500 r/min，離心5 min；PBS洗滌；加入異硫氰酸熒光素(FITC)進行免疫標記反應(100 μL細胞懸液：100 μL抗體)，避光孵育30 min；PBS 洗2次，每管加入200 μL 1%多聚甲醛固定，流式細胞儀檢測。此實驗重復3次，取最佳結果。

2 結 果

2.1 各組小鼠脾細胞增殖活性比較 見表1。

表1 各組小鼠脾細胞增殖活性比較 OD值，±s

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表1可見，總黃酮組各濃度OD值均高于對照組，均對小鼠脾淋巴細胞有刺激增殖作用(P<0.05，P<0.01)。

2.2 各組小鼠IFN-γ比較 見表2。

由表2可見，總黃酮組各濃度IFN-γ值均高于對照組(P<0.05，P<0.01)。

組 別濃度(mg/mL)3d6d9d對照組-3．78±0．245．42±1．248．54±1．36總黃酮組0．06255．45±1．41?8．71±1．65?15．65±3．41?0．1256．81±1．12??10．36±1．77??19．52±3．75??0．2507．85±1．47??12．54±2．78??21．54±3．54??0．5009．56±1．63??16．56±2．44??28．63±3．46??1．0009．48±1．77??16．53±2．55??28．57±4．31??

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 各組小鼠IL-2比較 見表3。

由表3可見，總黃酮組各濃度IL-2值均高于對照組(P<0.05，P<0.01)。

組 別濃度(mg/mL)3d6d9d對照組-3．65±0．217．34±1．3210．17±3．47總黃酮組0．06256．56±0．54?10．24±3．42??17．42±5．47??0．1258．59±2．33?12．52±3．14??20．47±5．24??0．2509．45±2．32??16．27±3．54??21．57±5．17??0．50011．44±3．12??19．64±5．41??32．27±6．61??1．00011．34±2．34??19．51±3．61??32．13±5．41??

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 各組CD3+細胞比較 見表4。

表4 各組CD3+細胞比較

與對照組比較，*P<0.01

由表4可見，總黃酮組CD3+細胞數高于對照組(P<0.01)。

2.5 各組CD19+細胞比較 見表5。

表4 各組CD19+細胞比較

由表5可見，總黃酮組CD19+細胞數與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

目前，黃芪桂枝五物湯廣泛應用于臨床治療各種疾病，能有效促進機體免疫功能，改善機體健康狀況。關于黃芪桂枝五物湯臨床應用的研究較多，已有文獻報道該方具有多種作用，如可改善糖尿病周圍神經病變微循環障礙[4]，一定程度的抗炎、鎮痛、抗氧化作用[5-6]，對小鼠具有免疫調節作用[7]，并且有研究表明該方有抑制佐劑性關節炎大鼠血清白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α升高的作用[8]。但該方有效成分對機體免疫功能的影響在國內外未見相關文獻報道。

機體的免疫功能是在淋巴細胞、單核細胞和其他有關細胞及其產物的相互作用下完成的，是免疫系統根據免疫識別而發揮作用。IL-2是T細胞生長因子，能刺激T細胞增殖，增強T細胞的殺傷活性，由IL-2誘導產生的T細胞輸入體內后可產生明顯抗腫瘤作用[9]。干擾素(IFN)-γ增加能增強免疫調節作用，誘導多種抗原提呈細胞表達主要組織相容性抗原(MHC)-Ⅰ或Ⅱ分子，活化單核、巨噬細胞，并增強溶菌活性及分泌IL-1、6、8，TNF-α等。CD3分子是T淋巴細胞表面標志物，CD19分子是B淋巴細胞表面標志物，可以看作CD3+細胞是T淋巴細胞、CD19+細胞是B淋巴細胞[10]。

我們采用黃兆勝等[11]對黃芪桂枝五物湯及其配伍抗炎鎮痛的比較研究，將該方按藥對研究法拆方分組，通過小鼠脾細胞體外實驗，探討總黃酮對免疫功能的影響。本實驗用黃芪桂枝五物湯中總黃酮分別對外周免疫器官(脾)、免疫細胞(CD3+、CD19+)及細胞因子(IL-2、IFN-γ)分別進行實驗。實驗結果表明，與對照組相比較，黃芪桂枝五物湯中的總黃酮能刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，促進IL-2和IFN-γ的分泌，且在一定濃度范圍內，隨著總黃酮濃度的增加，細胞增殖及細胞因子的分泌效果也隨之增加，具有明顯的量效關系，但當總黃酮濃度>0.500 mg/mL時，其增殖及分泌效果的量效關系不明顯，可能是藥物濃度過高對免疫細胞的毒性增強，導致其增殖不明顯，分泌效果差。本研究證明總黃酮可能具有增強機體細胞免疫功能的作用。經流式細胞儀檢測結果顯示，黃芪桂枝五物湯中的總黃酮對CD3+細胞作用明顯強于CD19+細胞，即對T細胞有促進增殖作用，但對B細胞作用不明顯，進一步證明總黃酮能增強機體細胞免疫，但可能對體液免疫作用不明顯。

黃芪桂枝五物湯各藥物協同作用后獲得的總黃酮對機體適應性免疫功能影響增強，主要是細胞免疫功能增強。細胞免疫的主要作用是抗病毒感染和抗腫瘤，可以指導臨床應用黃芪桂枝五物湯治療病毒感染及腫瘤，同時我們的研究結果可為其他研究者進行實驗提供重要的參考依據。

[1] 黃仰模.金匱要略講義[J].北京：人民衛生出版社，2003：71-72.

[2] 趙蕊.黃芪桂枝五物湯的臨床應用[J].黑龍江中醫藥，2007，36(4)：60-62.

[3] 邊洪榮，婁桂芹，張慶波，等.均勻設計黃芪桂枝五物湯不同劑量配比總黃酮含量的比較研究[J].中藥材，2010，33(2)：279-281.

[4] 馬麗.黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經病變微循環障礙的影響[J].遼寧中醫雜志，2006，33(2)：140-141.

[5] 許利平，胡曉梅，任桂華，等.黃芪桂枝五物湯加味的藥效學研究[J].四川生理科學雜志，1999，21(4)：30.

[6] 施旭光，朱偉，黃兆勝.黃芪桂枝五物湯及其配伍對佐劑性關節炎大鼠的抗炎、抗氧化作用研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2006，22(3)：3-5.

[7] 趙桂華，唐其風.黃芪桂枝五物湯對小鼠的免疫調節作用[J].中國冶金工業醫學雜志，2006，23(6)：708-709.

[8] 許曉峰，林斌，王沛堅.黃芪桂枝五物湯對AA大鼠血清IL-1β、TNF-α的影響[J].現代生物醫學進展，2007，7(8)：1202-1204.

[9] 楊孫鳳.細胞因子與格林巴利綜合征的研究進展[J].安徽醫學，2009，30(2)：148-150.

[10] 馬淑芹，劉印華，葛淑芝，等.酵母多糖對免疫功能的影響[J].河北醫藥，2013，35(15)：2245-2246.

[11] 黃兆勝，施旭光，朱偉，等.黃芪桂枝五物湯及其配伍抗炎鎮痛的比較研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2005，16(2)：93-96.

(本文編輯：曹志娟)

·信息·

嚴禁擅自組織幼兒及學生群體服藥

3月18日從教育部官方網站獲悉，針對陜西、吉林兩地個別幼兒園違規開展群體性服藥事件，教育部、國家衛生計生委于3月17日聯合發出通報強調，任何單位或個人不得擅自或越權組織幼兒及中小學生群體服藥。因常見疾病防治需要而組織幼兒及中小學生群體服藥時，要做到“五個必須”。

通報指出，個別幼兒園違規開展群體性服藥的行為嚴重違反了《教育部辦公廳、衛生部辦公廳關于加強和規范學生健康服務工作管理的通知》要求，造成嚴重的社會影響，有關部門正在依法依規進行查處。

通報要求，各地教育、衛生計生行政部門及幼兒園、中小學校必須按照有關文件規定，嚴格管理幼兒及學生健康服務工作。因常見疾病防治需要而組織幼兒及中小學生群體服藥時，必須事先經醫療衛生專家論證，必須經縣級以上衛生計生行政部門商同級教育行政部門同意，并制訂詳細的防治方案，必須堅持學生和家長知情同意、自愿參加的原則，必須有衛生技術人員進行現場指導，必須向證照俱全的正規醫藥生產、經營企業購買藥品。任何單位或個人不得擅自或越權組織幼兒及中小學生群體服藥。

EffectoftotalflavonesinHuangqiGuizhiWuwudecoctionofmiceonimmunefunctioninvitro

LIShuyi，ZHAOZhiqiang，ZHANGQingbo，etal.

BasicMedicalCollegeofHebeiUnitedUniversity，Hebei，Tangshan063000

ObjectiveTo research the effect of total flavones extracted from Huangqi guizhi wuwu decoction on immune function mice on in vitro，and to provide a reference for the clinical application.MethodsSplenic lymphocyte of mice were extracted，and stimulated with different concentration flavones.Proliferations of the cells were detected with WST-1 assay；IL-2，IFN-γ secreted by the cells were examined with enzyme linked immune sorbent assay (ELISA)；Cell subtypes were checked with flow cytometry (FCM).ResultsCompared with the control group，proliferation of the cells and concentration of IL-2，IFN-γ and CD3+in different concentration total flavones group increased significantly (P<0.05，P<0.01).ConclusionThe total flavones might enhance cellular immune function but not humoral immune function.

Huangqi Guizhi Wuwu decoction；Immune；IFN-γ；IL-2；Animal experiment

※ 項目來源：2013年唐山市科學技術研究與發展計劃增補項目(編號：13130253z)

△ 通訊作者：河北聯合大學基礎醫學院，河北 唐山 063000

1 河北聯合大學藥學院，河北 唐山 063000

李樹義(1974—)，副主任檢驗師，主治醫師，碩士研究生在讀。研究方向：中藥有效成分對機體免疫功能的影響。

R289.5；R285.5；R392-33

A

1002-2619(2014)03-0432-03

2013-10-25)