翼狀胬肉手術治療前后iNOS、TGF-β1與CD105變化分析

魯波

·論著·

翼狀胬肉手術治療前后iNOS、TGF-β1與CD105變化分析

魯波

目的探討翼狀胬肉手術治療前后iNOS、TGF-β1與CD105變化，分析相關生物學因子在翼狀胬肉中的表達機制。方法52例經過手術切除翼狀胬肉組織作為觀察組，取同期手術正常結膜組織52例作為對照組，2組都進行iNOS、TGF-β1與CD105免疫組化分析，同時進行淚膜破裂時間與淚液分泌試驗。結果對照組的BUT值與Schirmer值與觀察組比較差異有統計學意義(P<0.05)。在免疫組化分析中，對照組結膜組織層次清晰。觀察組結膜上皮細胞數量增加，排列不規則，成纖維細胞增生。同時觀察組的iNOS、TGF-β1與CD105表達陽性率明顯高于對照組(P<0.05)。結論iNOS、TGF-β1與CD105在翼狀胬肉發生發展中可能通過促進新生血管的形成從而提高其陽性率，選擇性抑制上述因子可有效治療翼狀胬肉與減少復發。

翼狀胬肉；iNOS；TGF-β1；CD105

翼狀胬肉是眼科的常見多發病，多發生于中老年人，發病率在1/3左右[1]。調查顯示，翼狀胬肉是一種和過度紫外線照射有關的侵入性、炎癥性和增生性眼表疾病，同時具有某些腫瘤樣特性，但當前關于翼狀胬肉的病因及發病機制尚未形成公認的理論[2]。手術是目前治療翼狀胬肉的主要手段，但是術后高復發率一直困擾著國內外眼科學工作者，局部使用絲裂霉素、自體結膜移植、β射線照射、聯合角膜緣干細胞移植等可以減少胬肉的復發[3，4]。近年來，隨著與眼科相關的分子生物學研究的深入，研究相關生物學特性的因子的變化可防治翼狀胬肉復發提供相關依據。NO是近年來發現的生物體內重要的細胞內信使分子，iNOS其可以抑制DNA修復酶的活性，提高腫瘤侵襲和轉移的能力[5]。TGF-β1與CD105也都具有多種生物功能，人們發現在多種腫瘤細胞中TGF-β1與CD105表達增高[6]。翼狀胬肉細胞的異常增殖以及術后復發的特性與腫瘤的生物學行為相似，為此iNOS、TGF-β1與CD105應該在翼狀胬肉的發生發展中發揮一定作用[7，8]。本文探討翼狀胬肉手術治療前后iNOS、TGF-β1與CD105變化，分析相關生物學因子在翼狀胬肉中的表達機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院眼科門診2010年8月至2013年2月收治的52例經過手術切除翼狀胬肉組織作為觀察組，其中男22例，女30例；年齡31～80歲，平均年齡(56.33±0.25)歲；病程1～30年，平均(4.56±0.11)年。取同期手術正常結膜組織52例作為對照組，男20例，女32例；年齡35～80歲，平均年齡(56.25±0.36)歲。2組取材前均經患者知情同意，所有病例均無其他角膜、結膜疾病。2組患者性別比、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 儀器與免疫組化試劑 實驗儀器主要包括切片機(Shandon AS325 德國萊卡公司)、生物組織自動包埋機(TB-718D2 湖北泰維醫療科技有限責任公司)、全自動生物組織脫水機(ZT-12J 英國Shandon 公司)等。主要試劑包括SP免疫組化試劑盒(DAK 公司)、兔抗人TGF-β1多克隆抗體(Invitrogen 公司)、兔抗人iNOS 多克隆抗體(NeoMarkers 公司)、鼠抗人CD105單克隆抗體(河北博海生物工程開發有限公司)。所有標本經10%甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋。然后采用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中脫蠟，乙醇梯度水化，室溫孵，消除內源性過氧化物酶活性；蒸餾水中沖洗，抗原修復；室溫放置，PBS泡洗，滴加一抗，PBS泡洗，滴加適當比例稀釋的二抗，37℃孵育；PBS漂洗， DAB顯色，顯微鏡下觀察3～10 min。

1.3 結果判定 所有切片均經病理科副主任醫師協助觀察，在高倍顯微鏡下(×200)隨機選擇5個視野，iNOS、TGF-β1與CD105表達結果分別記錄為陰性(-)：無陽性細胞；弱陽性(+)：陽性細胞率小于50%；強陽性(++)：切片中陽性細胞率大于50%。弱陽性、中度陽性及強陽性表達都為陽性表達。2組同時進行淚膜破裂時間(BUT)實驗測定與淚液分泌實驗測定。

2 結果

2.1 淚膜破裂時間與淚液分泌試驗結果比較 2組淚膜破裂時間與淚液分泌試驗結果比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組淚膜破裂時間與淚液分泌試驗結果比較

表1 2組淚膜破裂時間與淚液分泌試驗結果比較

組別淚液分泌試驗(mm/5min)淚膜破裂時間(s)觀察組9.97±0.349.65±0.26對照組10.40±0.1610.86±0.83t值12.63513.698P值<0.05<0.05

2.2 iNOS表達情況 iNOS主要陽性部位為翼狀胬肉組織細胞的細胞膜。對照組結膜組織層次清晰。觀察組結膜上皮細胞數量增加，排列不規則，成纖維細胞增生。觀察組的iNOS表達陽性率明顯高于對照組(P<0.05)。見圖1、2，表2。

圖1 正常結膜組織iNOS(HE×200)

圖2 翼狀胬肉組織iNOS(HE×200)

2.3 TGF-β1表達情況 TGF-β1主要陽性部位為翼狀胬肉組織細胞的細胞質，包括成纖維細胞、血管內皮細胞、基底細胞和上皮細胞等，同時觀察組的TGF-β1表達陽性率明顯也高于對照組(P<0.05)。見圖3、4，表2。

圖3 正常結膜組織TGF-β1(HE×200)

圖4 翼狀胬肉組織TGF-β1(HE×200)

2.4 CD105表達情況 CD105主要在翼狀胬肉組織的上皮細胞、新生血管的胞質內表達，同時觀察組的CD105表達陽性率明顯也高于對照組(P<0.05)。見圖5、6，表2。

3 討論

翼狀胬肉是一種臨床上比較常見且多發的慢性眼表疾病。目前普遍認為翼狀胬肉是多因素共同作用的結果，比如在紫外線照射下，成纖維細胞轉化并引發機體免疫反應，身體正常的免疫反應激活肥大細胞并釋放出大量細胞因子，參與新生血管形成[9]；肥大細胞釋放大量活性物質及轉化的成纖維細胞表達異常蛋白影響改變了其生存的微環境，導致角膜散光、眼球轉動受限和眼部刺激癥狀，給患者造成巨大的痛苦。研究表明淚膜功能異常是導致干眼癥、角膜、結膜病變等多種眼表疾病的重要原因[10，11]。本文對照組的淚膜破裂時間和淚液分泌試驗值與觀察組比較差異有統計學意義(P<0.05)。表明淚膜的正常與穩定是維持眼表上皮正常結構和功能的基礎，各種原因引起淚膜不穩定是翼狀胬肉發生的重要原因。

圖5 正常結膜組織CD105(HE×200)

圖6 翼狀胬肉組織CD105(HE×200)

表2 iNOS、TGF-β1與CD105表達陽性率比較 n=52，例(%)

由于在翼狀胬肉中發現了多種腫瘤相關基因的異常表達，且翼狀胬肉雖不是腫瘤，但卻具有與腫瘤類似的特點。NO對于凋亡的調節具有兩面性、細胞類型特異性和濃度依賴性的特點。在正常生理條件下，各組織細胞的iNOS活性幾乎不表達，病理狀態下主要受一些細胞因子的誘導而激活。TGF-β1是一類對靶細胞具有多種特殊作用的多肽，通常狀態下TGF-β1就以這種無活性或潛在活性形式分泌，在特定條件下，無活性的TGF-β1就轉變為了有活性的TTGF-β1，后者與相應受體結合，發揮其生理功能[12]。一般來說，TGF-β1表達在翼狀胬肉組織中有顯著增加，尤以復發性翼狀胬肉組織中為甚。CD105是一類新的細胞粘附分子，是一種與增生有關的內皮細胞的細胞膜抗原，在與腫瘤有關的新生血管內皮強烈表達。在非小細胞肺癌、宮頸癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織中，CD105標識的微血管密度值優于CD34等標記的微血管密度值[13]。本文結果顯示，對照組結膜組織層次清晰。觀察組結膜上皮細胞數量增加，排列不規則，成纖維細胞增生。同時觀察組的iNOS、TGF-β1與CD105表達陽性率明顯高于對照組(P<0.05)。

綜上所述，iNOS、TGF-β1與CD105在翼狀胬肉發生發展中可能通過促進新生血管的形成從而提高其陽性率，選擇性抑制上述因子可成為手術治療翼狀胬肉與減少復發的新思路。

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437000 湖北省咸寧市第一人民醫院眼科

R 777.33

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1002-7386(2014)08-1171-03

2013-12-11)