巢式實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測結核分枝桿菌DNA的臨床應用

孟小蓉 包 勇 李 凱 曹 敏 紀風兵

結核病是全球主要公共衛生問題之一，嚴重危害人類健康。雖然近年來全球防控措施逐漸增強，但其龐大的患病基數、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染率上升、多耐藥結核菌株增加等原因導致結核病的防控仍面臨嚴峻形勢[1]。世界衛生組織(WHO)2012結核病報告顯示2011年全球新增結核病例870萬，死亡140萬[1]。診斷延遲是導致我國結核病防治工作進度緩慢的最主要原因[2]。目前，傳統病原學檢測方法如抗酸桿菌涂片和結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)培養，存在敏感性低、特異性差、操作繁瑣、檢測周期長等缺點。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)技術以其高敏感性、操作簡單快捷、不受環境和患者體質及用藥影響等優點在結核病早期診斷中具有優越性，其中以能夠準確定量、動態監測的實時熒光定量PCR技術最為常用。但是，該方法存在費用高、特異性差、對底物模板濃度要求高等缺點，使其對于單位體積MTB微量的樣本敏感性更低，假陰性率升高。目前有學者將實時熒光定量PCR和巢式PCR兩種技術結合，即巢式實時熒光定量PCR(quantitative nested real-time polymerase chain reaction, QNRT-PCR)，用于乙肝病毒、人T細胞白血病病毒、人乳頭瘤病毒等檢測，均證實其有效彌補了實時熒光定量PCR缺點，具有更好的臨床應用價值[3-5]。目前尚無將此方法應用于MTB DNA含量檢測的報道，本研究擬建立QNRT-PCR檢測MTB DNA方法，旨在探討其在結核病診斷中的臨床應用價值。

材料與方法

一、實驗材料

1. 樣本收集： 本研究自2012年6月至2013年10月，共采集24例肺結核患者痰液(取患者清晨漱口后留取晨痰于清潔痰杯中，1 h內送檢)24份，25例結核性胸膜炎患者胸水(于胸腔穿刺后留取60 ml胸水于高壓滅菌玻璃瓶內，立即分離，若不能立即分離樣本置于4 ℃保存，不超過72 h)27份，對照組痰和胸水共75份。所有病例均取自成都市第三人民醫院呼吸內科、成都市傳染病院以及成都醫學院第一附屬醫院傳染病科[6-7]。 其中，肺結核的確診以痰培養為“金標準”。結核性胸膜炎為臨床診斷，診斷標準如下：①患者有結核中毒癥狀并伴有胸腔積液；②胸腔積液生化檢測為滲出液；③至少觀察抗結核治療1個月有效，胸腔積液未再復發；④排除其它性質胸腔積液。

2.儀器試劑： 3.5熒光定量PCR儀(羅氏，瑞士)、PCR儀(Bio-RAD，美國)、低溫冷凍離心機(Thermo)、低速離心機(Thermo)、六一普通水平電泳儀(北京)、核酸蛋白分子成像儀(德國，Eppendorf)；細菌DNA提取試劑盒(全式金)、普通PCR試劑盒(全式金)、熒光定量PCR試劑盒(全式金)、針對特異結核分枝桿菌復合群MPT64基因設計引物[8]，具體序列如下：外套上游引物(F-1): 5′-ATCCGCTGCCAGTCGTCTTCC-3′，外套下游引物(R-2):5′-CTCGCGAGTCTAGGCCAGCAT-3′，內套上游引(F-2): 5′-CATTGTGCAAGGTGAACTGAGC-3′，內套下游引物(R-2)：5′-AGCATCGAGTCGATCGCGGAA-3′由上海生物工程股份有限公司合成，擴增片段分別為241 bp和201 bp。

二、實驗方法

1. 標本前處理及DNA提取： 取痰液0.5 ml或胸水60 ml，以2～8 ℃，離心半徑8 cm，12 000 r/min離心15 min，棄上清液；然后加生理鹽水500 μl，斡旋混勻，室溫下，以半徑離心8 cm，12 000 r/min離心3 min，棄上清液，重復三次，取沉淀物提取DNA或-20 ℃保存備用。DNA的提取采用細菌DNA提取試劑盒(全式金)，嚴格按照操作步驟進行。

2. 構建標準品： 以H37vRV標準菌株(由成都市第三人民醫院實驗醫學部保存提供)為模板，采用F-2、R-2內套引物，進行常規PCR擴增，反應條件為引物各0.6 μl，Mix 12.5 μl，模板2 μl，加ddH2O至25 μl體系，擴增目的片段為201 bp，設置參數為94 ℃預變性3 min，然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min循環25次，72 ℃延伸10 min，反應完成后取PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析，在略大于200 bp處可見目的條帶，將目的條帶割膠回收與pGM-T載體連接，16 ℃過夜，并將連接液轉化入大腸桿菌αH5感受態細胞進行氨芐抗生素篩選，再進行搖菌擴大培養，最后提取質粒行PCR電泳和測序鑒定，紫外分光光度計測定鑒定正確質粒OD260為0.5，OD260/OD280為1.83，根據公式：質粒拷貝數濃度(拷貝/ml)=(質量÷分子量)×6.02×1023，計算出質粒拷貝濃度為7.09×1012拷貝/ml，將其10倍系列稀釋成含有1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108copy/μl的6個梯度， 作為檢測MTB DAN的陽性參照定量標準品[8]。

3. 標準曲線的建立: 將7.09×1012拷貝/ml質粒倍比稀釋后取7.09×102～7.09×109copy/μl的8個梯度，得到該方法在1×104～1×108拷貝/ml范圍內，隨著起始模板量的減少，對應的Ct值(每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數)相應增大，兩者間呈線性關系，r=0.99，且溶解曲線呈單峰，見圖1。

注：A：擴增曲線；B：標準曲線；C：溶解曲線

4. QNRT-PCR反應體系及條件: QNRT-PCR反應分兩步，第一步，采用Bio-RAD PCR儀，反應體系為10 μl 2×PCR mix，引物F-1和R-1各0.16 μl，ddH2O 8.68 μl，模板(DNA提取物)2 μl，共20 μl體系，反應條件為預變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，復性72 ℃ 1 min，循環15次，然后再72 ℃ 10 min，循環1次；第二步，采用3.5熒光定量PCR儀，反應體系為2×qPCR mix 15 μl，enhancer 0.4 μl，引物F-2和R-2各0.2 μl，ddH2O 15 μl，模板為第一輪PCR反應產物0.15 μl，共30 μl反應體系，反應條件為熒光定量PCR兩步法，即預變性94 ℃ 3 min，循環1次，然后變性94 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，循環35次，溶解曲線溫度40～80 ℃。同時，所有樣本均進行巢式PCR和熒光定量PCR方法檢測，定量PCR反應條件同巢式實時熒光定量PCR第二步，巢式PCR反應條件第一步同巢式實時熒光定量PCR，第二步為預變性94 ℃ 3 min，循環1次，變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，復性72 ℃ 1 min，循環25次，最后再72 ℃ 10 min，循環1次。

三、統計學方法

數據采用SPSS 19.0軟件分析，兩組計數資料分析采用卡方檢驗，兩組均數間比較采用兩樣本比較t檢驗，組內兩種PCR檢測方法間的比較采用配對t檢驗，P<0.05表示具有統計學意義。

結 果

一、 患者的基本臨床特征

本研究共納入126例患者，其中肺結核24例，結核性胸膜炎滲出性27例，對照組病例主要為普通細菌性肺炎、肺真菌病、惡性胸腔積液、漏出性胸腔積液。所有患者的臨床信息，包括年齡、性別、結核分枝桿菌培養和涂片、病理組織學、胸部影像學結果等，見表1。

表1 患者臨床資料

二、QNRT-PCR特異性、敏感性、重復性

以痰培養結核分枝桿菌陽性肺結核確診標準，檢測24份來自肺結核患者的痰MTB DNA，結果敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為95.83%、61.54%、69.70%和94.12%；以內科胸腔鏡胸膜活檢的組織病理學結果為金標準，巢式實時熒光定量PCR敏感性和特異性分別為75%和100%； 另外，所有檢測結果至少重復2次，統計學結果無差異(P<0.05)，重復性好，見表2。

表2 QNRT-PCR診斷性能

QNRT-PCR、實時熒光定量PCR、巢式PCR三種方法檢測結果比較陽性率差異具有統計學意義(P<0.05)，QNRT-PCR的敏感性最高；且兩種定量PCR檢測結果比較，QNRT-PCR的 Ct值較小，見表3。

表3 三種PCR方法比較

三、QNRT-PCR在結核性胸膜炎的臨床應用

本研究進一步將QNRT-PCR用于胸水中MTB DNA的檢測。結果顯示：在27例臨床診斷結核性胸膜炎患者中，該方法檢測陽性率達70.37%，明顯高于單獨采用熒光定量PCR及巢式PCR的陽性率66.67%及11.11%。

討 論

QNRT-PCR是一種新的PCR技術，是在巢式PCR和定量PCR基礎上改進和創新的技術。在結核病的診斷中，有日本學者先后于2006年、2008年兩次報道應用該方法檢測腦脊液中MTB DNA，敏感性和特異性分別為95.8%、100%，但樣本例數僅有25例[10]。本研究首次以痰和胸水為樣本，評價了QNRT-PCR在肺結核和結核性胸膜炎診斷中的檢驗性能，同時增加樣本量及樣本類型。

眾所周知，傳統的實時熒光定量PCR技術常用于臨床樣本的感染性病原體DNA定性和/或定量檢測，但極少用于MTB DNA的準確定量[11-14]。因此，本研究以結核分枝桿菌MPT64基因部分序列為目的片段進行了分子克隆，構建了標準品，能準確定量底物模板中的拷貝數，并以培養為金標準，共檢測了50份痰樣本。QNRT-PCR敏感性高達95.83%，明顯高于本研究中同步進行的實時熒光定量PCR 40%的敏感性，且前者Ct值的均數和標準差更小。分析其可能的原因有: ①本研究采用了本實驗室新的細菌DNA提取方法，提高了DNA的提取效率；②MPT64基因被認為MTB最敏感和特異的序列[8]，以其合成特異的引物有利于提高PCR擴增效率；③在定量PCR中，本研究運用高敏感性的SYBR Green染料法；④最重要的是，該方法中巢式PCR技術的應用，同傳統的一步實時熒光定量PCR技術相比較，進一步提高了檢測的敏感性和特異性。

在26份培養陰性的痰標本中，QNRT-PCR檢測陽性10例(38%)。與此不同的是2例病理組織學陰性的痰標本QNRT-PCR結果都呈陰性；另一方，本研究同時對MTB、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、白色念珠菌共5株標準菌株的DNA進行檢測，除MTB外，其它菌株及陰性對照Ct值>35或未擴增，再行瓊脂糖凝膠電泳顯示僅有MTB菌株樣本在201 bp處見清晰條帶，其它菌株及陰性對照結果均呈陰性。因此，本研究中較高的假陽性可能與MTB培養-即“金標準”本身敏感性低有關。另外，臨床樣本的混合性、復雜性，也有可能是影響PCR擴增結果的因素。

由于發病機制的原因，結核性胸膜炎的病原學診斷一直是個難題，胸水MTB培養敏感性僅有10%～35%[14]。在本研究中，共檢測27例臨床診斷結核性胸膜炎患者的27份胸水，QNRT-PCR、實時熒光定量PCR、巢式PCR、陽性率分別為74.37%、66.67%、11.11%。結果表明，針對胸水這種少量MTB樣本特性，QNRT-PCR具有明顯的優越性。

QNRT-PCR檢測是一種合并巢式PCR高敏感性和實時熒光定量PCR動態監測、準確定量的新技術，進一步提高了其檢測的特異性、增加了檢測樣本量及樣本類型，將有利于臨床結核病的診斷。

參 考 文 獻

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