非小細胞肺癌組織中表皮生長因子受體基因突變與ERCC1和RRM1mRNA表達的關系

田玉旺 許春偉 高文斌 張玉萍 李 揚 亓崠東

在全球范圍內，肺癌已躍居成為發病率和病死率最高的惡性腫瘤[1-2]。肺癌中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占80%～85%[3]。人表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)屬于Ⅰ型受體家族，其家族成員主要包括EGFR(HER1)、HER2、HER3、HER4四種同源受體，其介導的細胞信號轉導通路有：RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路、PLC-γ通路、PI3K-PDK通路和JAK-STAT通路[4]。它們調控細胞的增殖、分化和凋亡等[5]。NSCLC患者中EGFR的基因突變主要發生在胞內TK區域前四個外顯子之上(18～21)，目前報道發現的TK區域突變有30多種[6]，最常見的是19和21外顯子突變約占85%[7]。

核苷酸切除修復(nucleotide excision repair, NER)是主要的修復途徑，切除修復交叉互補基因1(excision repair cross-complementation group 1, ERCC1)是NER和鏈內交聯修復這2種DNA修復途徑中的關鍵基因[8]，它的過表達可使停滯在G2/M期的損傷DNA迅速修復導致其對鉑類耐藥[9]。核苷酸還原酶亞單位M1(ribonucleotide reductase subunit M1, RRM1)為DNA合成與修復提供脫氧核糖核酸[10]。

本研究通過多中心回顧研究257例Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者的EGFR基因突變與ERCC1和RRM1mRNA表達情況，并對其相互其關系進行分析。旨在了解NSCLC患者EGFR基因突變與組織中這2 種耐藥相關基因表達情況的關系，為進一步探索EGFR基因突變患者更有效的個體化治療方案，特別是對EGFR小分子酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)原發或繼發耐藥部分患者的個體化治療方案加以探討。

材料與方法

一、實驗材料

1. 實驗標本： 收集北京軍區總醫院、大連大學附屬中山醫院、山東省濰坊市人民醫院2004年至2013年間進行手術、術后病理診斷為肺腺癌且術前未經化療、放療及生物免疫治療患者的癌組織蠟塊標本257例(其中北京軍區總醫院103例，大連大學附屬中山醫院58例，山東省濰坊市人民醫院96例)，進行EGFR基因突變，ERCC1和RRM1mRNA檢測。

2. 主要試劑和儀器： DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，RNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，人EGFR基因突變定性檢測試劑盒(廈門艾德有限公司)，腫瘤相關基因表達量相對定量檢測試劑盒(ERCC1和RRM1，廈門艾德有限公司)，核酸蛋白質濃度測量儀B-500(上海創萌生物科技有限公司)，ABI7500 實時熒光定量PCR儀(美國life tech公司)。

二、實驗方法

1. 實時熒光定量PCR檢測NSCLC組織中EGFR基因突變： 取4 μm厚度的石蠟組織切片4～8片，脫蠟。按照提取基因組DNA試劑盒(QIAamp DNA FFPE Kit，德國QIAGEN公司)說明書提供的方法提取組織DNA，應用分光光度計檢測所提取DNA 的純度和濃度。以此DNA為模板，按照人EGFR基因突變定性檢測試劑盒(廈門艾德有限公司)說明書提供的方法，在ABI7500 實時熒光定量PCR儀(美國life tech公司)中進行擴增，該試劑盒包含擴增EGFR 基因18、19、20和21外顯子29種突變的引物及探針。

2. 實時熒光定量PCR檢測NSCLC組織中ERCC1和RRM1mRNA的表達: 取4 μm厚度的石蠟組織切片4～8片，脫蠟。按照提取基因組RNA試劑盒(QIAamp RNeasy FFPE Kit，德國QIAGEN公司)說明書提供的方法提取組織RNA，應用分光光度計檢測所提取RNA 的純度和濃度。按照腫瘤相關基因表達檢測試劑盒(ERCC1和RRM1，廈門艾德有限公司)說明書提供的方法，在ABI7500 實時熒光定量PCR儀(美國life tech公司)中進行擴增。用絕對定量法，以β-actin為內參基因對ERCC1和RRM1基因mRNA表達進行檢查， ERCC1標準均值為4.29×10-3，RRM1標準均值為11.37×10-3(福建廈門艾德有限公司)。

三、統計學方法

所有數據采用SPSS19.0統計軟件，結果運用χ2及Fisher確切概率法，檢驗水準α=0.05，并設定P值為雙側分布，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、EGFR基因突變以及ERCC1和RRM1mRNA表達與患者臨床特征的關系，見表1、圖1、2。 257例NSCLC患者組織中EGFR基因突變126例(49.03%)；EGFR基因突變在女性(74/119，62.18%)和不吸煙(92/158，58.23%)患者中較高(P=0.000，P=0.000)，但與患者的年齡、腫瘤大小、淋巴結是否轉移及臨床分期等臨床特征無關。257例NSCLC患者組織中ERCC1mRNA高表達者122例(47.47%)，低表達者135例(52.53%)。ERCC1mRNA表達水平與患者的性別、年齡、吸煙情況、腫瘤大小、淋巴結是否轉移及臨床分期等臨床特征無關。257例NSCLC患者組織中RRM1mRNA高表達者159例(61.87%)， 低表達者98例(38.13%)。RRM1mRNA表達水平與患者的性別、年齡、吸煙情況、腫瘤大小、淋巴結是否轉移及臨床分期等臨床特征無關。見表1，圖1、2。

圖1 ERCC1低表達

圖2 RRM1高表達

表1 EGFR基因突變以及ERCC1和RRM1mRNA表達與患者臨床特征間的關系

二、EGFR基因突變與ERCC1mRNA表達水平間的關系

126例EGFR基因突變型的NSCLC患者中，ERCC1mRNA低表達者79例(62.70%)。131例EGFR基因野生型的NSCLC患者中，ERCC1mRNA低表達者56例(42.75%)，EGFR基因突變的NSCLC患者傾向于ERCC1mRNA低表達，62.70%vs. 42.75%，P<0.05，見表2。

表2 NSCLC組織中EGFR基因突變與ERCC1mRNA表達水平間的關系

三、EGFR基因突變型與RRM1mRNA表達水平間的關系

126例EGFR基因突變型的NSCLC患者中，RRM1mRNA低表達者51例(40.48%)。131例EGFR基因野生型的NSCLC患者中，RRM1mRNA低表達者47例(35.88%)。NSCLC組織中EGFR基因突變型與RRM1mRNA表達水平無關，40.48%vs. 35.88%，P>0.05，見表3。

表3 NSCLC組織中EGFR基因突變與RRM1mRNA表達水平間的關系

四、ERCC1與RRM1mRNA表達水平間的關系

122例ERCC1mRNA高表達的NSCLC患者中，RRM1mRNA高表達者72例(59.02%)。135例ERCC1mRNA低表達的NSCLC中，RRM1mRNA低表達者48例(35.56%)。ERCC1與RRM1mRNA兩樣表達水平一致者120例(46.69%)，不一致者137例(53.31%)，兩種表達間關聯不顯著(χ2=0.800，P=0.371)，見表4。

表4 ERCC1與RRM1mRNA表達水平間的關系

討 論

EGFR基因突變與分子靶向藥物吉非替尼(商品名：易瑞沙)和厄洛替尼(商品名：特羅凱)在NSCLC患者療效中存在密切關系[13-14]。研究發現小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)在EGFR基因19外顯子缺失突變患者中的有效率較高[16]，但在EGFR 基因20外顯子突變的NSCLC患者中，對TKIs產生原發耐藥[17]。國外有研究報道采用核苷酸剪切修復復合體的患者預后較好，但不適合接受鉑類藥物化療[18-19]。

本研究結果顯示，Ⅰ～Ⅳ期NSCLC患者中EGFR基因突變率為48.03%(126/257)，在女性和不吸煙患者中較高(P<0.05)，與國外報道基本一致[20-21]。本組NSCLC患者中ERCC1的高表達率為47.47%(122/257)，略高于其他研究中NSCLC患者ERCC1的高表達率[22]。本組NSCLC組織中RRM1表達率為61.87%(159/257)，與其他研究結果基本一致，且ERCC1及RRM1表達水平均與患者的性別、年齡、吸煙情況、腫瘤大小、淋巴結轉移情況和病理分期等臨床特征無關[23]。

本研究發現，NSCLC患者中EGFR基因野生型與ERCC1表達水平有關(P<0.05)，EGFR基因突變型患者ERCC1低表達者較多，但NSCLC組織中EGFR基因突變型與RRM1表達水平間無關(P>0.05)。國外研究發現NSCLC患者EGFR基因突變型與ERCC1表達水平相關(P<0.001)，并且在腺癌亞組中，EGFR基因突變型與ERCC1表達水平亦有相關性(P=0.001)[24]。研究表明細胞中核苷酸切除修復酶損傷可導致細胞中基因不穩定性增加，使突變率升高[25]。由于ERCC1低表達的癌細胞DNA損傷修復能力低，因此EGFR基因更易出現突變，對以鉑類為基礎的化療敏感。這可能是EGFR基因突變型的NSCLC患者對化療有較高反應率的內在機制的理論依據之一。

本研究發現，NSCLC組織中EGFR基因突變與ERCC1有關(P<0.05)，但與RRM1表達水平無關(P>0.05)。這與Reynolds等[26]的研究結果不一致，目前對于ERCC1和RRM1表達間的關系仍存在爭議，需要更多的研究進一步證實。目前很多研究已證實，根據ERCC1和RRM1的表達水平進行選擇用藥存在合理性，且可以延伸到NSCLC患者[27]。

本研究初步明確了NSCLC患者EGFR突變型中ERCC1傾向低表達，推測EGFR突變型NSCLC患者應用以順鉑為基礎的化療有效率高，但其內在的分子機制尚需進一步研究。同時，本研究未發現EGFR突變的NSCLC患者中RRM1表達水平有差異。本研究僅對一線化療藥中的鉑類和他濱類藥物耐藥基因與EGFR基因突變進行了研究，并未對一線化療藥中的微管類藥物耐藥基因TUBB3、胸苷酸合成酶耐藥基因TYMS進行研究。因此期待關于EGFR基因突變與微管類耐藥基因TUBB3和胸苷酸合成酶耐藥基因TYMS方面的研究，以進一步探索更有效的個體化治療方案，特別期待對EGFR-TKI原發或繼發耐藥部分患者的個體化治療方案的研究報道。

參 考 文 獻

1 錢桂生. 肺癌不同病理類型發病率的變化情況及其原因[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版, 2011, 4(1): 1-6.

2 Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

3 Sher T, Dy GK, Adjei AA. Small cell lung cancer[J]. Mayo Clin Proc, 2008, 83(3): 355-367.

4 Cao C, Lu S, Sowa A, et al. Priming with EGFR tyrosine kinase inhibitor and EGF sensitizes ovarian cancer cells to respond to chemotherapeutical drugs[J]. Cancer Lett, 2008, 266(2): 249-262.

5 Herbst RS. Review of epidermal growth factor receptor biology[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004, 59(2 Suppl): 21-26.

6 Sharma SV, Bell DW, Settleman J, et al. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2007, 7(3): 169-181.

7 Chan SK, Gullick WJ, Hill ME. Mutations of the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer-search and destroy[J]. Eur J Cancer, 2006, 42(1): 17-23.

8 Simon GR, Ismail-Khan R, Bepler G. Nuclear excision repair-based personalized therapy for non-small cell lung cancer: from hypothesis to reality[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2007, 39(7-8): 1318-1328.

9 Rosell R, Lord RV, Taron M, et al. DNA repair and cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer[J]. Lung Cancer, 2002, 38(3): 217-227.

10 Su C, Zhou S, Zhang L, et al. ERCC1, RRM1 and BRCA1 mRNA expression levels and clinical outcome of advanced non-small cell lung cancer[J]. Med Oncol, 2011, 28(4): 1411-1417.

11 Mok TS, Wu YL, Thongprasert S, et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma[J]. N Engl J Med, 2009, 361(10): 947-957.

12 Olaussen KA, Dunant A, Fouret P, et al. DNA repair by ERCC1 in non-small-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy[J]. N Engl J Med, 2006, 355(10): 983-991.

13 Bepler G, Kusmartseva I, Sharma S, et al. RRM1 modulated in vitro and in vivo efficacy of gemcitabine and platinum in non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2006, 24(29): 4731-4737.

14 Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J]. N Engl J Med, 2004, 350(21): 2129-2139.

15 Paez JG, Janne PA, Lee JC, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy[J]. Science, 2004, 304(5676): 1497-1500.

16 Riely GJ, Pao W, Pham D, et al. Clinical course of patients with non-small cell lung cancer and epidermal growth factor receptor exon 19 and exon 21 mutations treated with gefitinib or erlotinib[J]. Clin Cancer Res, 2006, 12(3 Pt 1): 839-844.

17 Kobayashi S, Boggon TJ, Dayaram T, et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib[J]. N Engl J Med, 2005, 352(8): 786-792.

18 Ceppi P, Volante M, Novello S, et al. ERCC1 and RRM1 gene expressions but not EGFR are predictive of shorter survival in advanced non-small-cell lung cancer treated with cisplatin and gemcitabine[J]. Ann Oncol, 2006, 17(12): 1818-1825.

19 Cobo M, Isla D, Massuti B, et al. Customizing cisplatin based on quantitative excision repair cross-complementing 1 mRNA expression: a phase Ⅲ trial in non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2007, 25(19): 2747-2754.

20 Pao W, Miller V, Zakowski M, et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from “never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101(36): 13306-13311.

21 Paez JG, J?nne PA, Lee JC, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy[J]. Science, 2004, 304(5676): 1497-1500.

22 鄧秋華, 邱 源, 莫明聰, 等. 非小細胞肺癌表皮生長因子受體基因拷貝數與核苷酸切除修復交叉互補基因1和乳腺癌易感基因1的表達及其相關性分析[J]. 中華腫瘤雜志, 2011, 33(7): 508-512.

23 林肖鷹, 陳小巖, 陳志忠. 非小細胞肺癌組織ERCC1和RRM1表達及其臨床預后的相關性研究[J]. 福建醫科大學學報, 2011, 45(1): 10-14.

24 Gandara DR, Grimminger P, Mack PC, et al. Association of epidermal growth factor receptor activating mutations with low ERCC1 gene expression in non-small cell lung cancer[J]. J Thorac Oncol, 2010, 5(12): 1933-1938.

25 Mitsudomi T, Morita S, Yatabe Y, et al. Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomised phase 3 trial[J]. Lancet Oncol, 2010, 11(2): 121-128.

26 Reynolds C, Obasaju C, Schell MJ, et al. Randomized phase Ⅲ trial of gemcitabine-based chemotherapy with in situ RRM1 and ERCC1 protein levels for response prediction in non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2009, 27(34): 5808-5815.

27 Simon GR, Schell MJ, Begum M, et al. Preliminary indication of survival benefit from ERCC1 and RRM1-tailored chemotherapy in patients with advanced nonsmall cell lung cancer: evidence from an individual patient analysis[J]. Cancer, 2012, 118(9): 2525-2531.