肺腺癌細胞系H114的建立

馮 延 徐 瑜 胡義德

肺癌已成為我國惡性腫瘤發病率最高的疾病，其發病率為53.57/105，并成為我國惡性腫瘤的頭號殺手，2009年肺癌的病死率達45.57/105，即我國每年死于肺癌的患者近70萬人[1-2]。因此，肺癌在我國的腫瘤防治中占有特殊的地位。為進一步研究我國肺癌的發病機制、治療方法及預防策略，本研究組應用原代培養的方法，在肺腺癌患者胸腔積液中新建立了一株人肺腺癌細胞系，旨在為我國肺癌研究提供新的模型。目前已經在體外培養8個月，傳代40余代，生長穩定，定名為H114細胞系。現將建株經過報道如下。

材料與方法

一、實驗材料

1. 腫瘤標本來源： 2013年1月14日取材于第三軍醫大學新橋醫院腫瘤科胸腔穿刺抽取的肺腺癌性胸腔積液。患者男性，48歲，重慶市永川區人，其組織病理診斷為右上肺中-高分化管狀腺癌T3N1M1 Ⅳ期，本次胸水脫落細胞檢測查見癌細胞。

2. 主要試劑： 裸小鼠1只購于新橋醫院實驗動物中心，3周齡，雄性，體質量14 g，無菌層流室飼養。改良型RPMI 1640、胰酶購自美國HyClone公司。標準胎牛血清、淋巴細胞分離液購自美國TBD公司。紅細胞裂解液購自天根生化科技(北京)有限公司。青霉素-鏈霉素溶液購自碧云天生物技術研究所。

3. 儀器設備： 二氧化碳恒溫孵箱(Heal Force)購自香港力康發展有限公司。超潔工作臺購自蘇州蘇潔凈化設備有限公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡儀器有限公司。立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫療器械廠。高速離心機購自長沙平凡儀器儀表有限公司。恒溫水溫箱購自上海浦東榮豐科學儀器有限公司。壓力驅動無菌過濾器購自美國Millipore公司。

二、實驗方法

1. 細胞培養： 選擇我國男性肺腺癌患者，經患者及其家屬同意，并簽署知情同意書，在腫瘤科穿刺室獲取胸腔穿刺抽取的胸腔積液200 ml，置無菌玻璃瓶中，迅速轉入無菌實驗室內，將上述胸腔積液在無菌操作臺內分裝于4個50 ml離心管中，以離心半徑8 cm，2000 r/min離心15 min，棄上清，加入細胞沉淀體積的3～5倍紅細胞裂解液，充分混勻，室溫下以離心半徑8 cm，1500 r/min 離心10 min，棄上清，若紅細胞未裂解充分，可重復紅細胞裂解步驟一次，然后按2︰1比例將細胞懸液輕輕滴入盛有淋巴細胞分離液的離心管，以離心半徑8 cm，2000 r/min 離心15 min，見液體分為四層，棄上面三層，將最下層細胞用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的改良型RPMI1640制成細胞懸液；以1×106細胞密度接種于25 cm2無菌玻璃培養瓶中，置37 ℃、5%二氧化碳恒溫孵箱中培養，當細胞貼滿瓶壁的90%～95%時用0.25%胰蛋白酶消化后按1︰2～1︰3比例進行傳代[3]。

2. 形態學觀察： 每1～2 d將培養細胞放倒置熒光顯微鏡下觀察細胞生長、增殖情況并拍照；倒置顯微鏡觀察染色后細胞分裂指數。

3. MTT比色法測定肺腺癌細胞生長曲線： 細胞傳到30代時，收集對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，血球計數板計數，按6×103細胞密度接種于96孔板，并做6個復孔，共接種7塊培養板，同時以不加細胞只加等體積培養基的孔為空白對照，置37 ℃、5%二氧化碳恒溫孵箱中分別培養24/48/72/96/120/148/172 h后；每孔加入20 μl的MTT溶液(5mg/mL)后繼續培養4 h；培養結束后，小心吸去孔內培養液，每孔再加入150 μl二甲基亞礬(dimethyl sulfoxide, DMSO)，置搖床上低速震蕩10 min使MTT藍紫色結晶完全溶解，用酶聯免疫檢測儀于490 nm處檢測各孔細胞的吸光度(A)值。

4. 異種移植: 當細胞長滿培養瓶80%時，用0.25%胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，以2×106個細胞(0.2 ml)接種于1只裸鼠(雄性)兩側臀部(購自新橋醫院實驗動物中心，動物合格證號SYXK渝2012-0011，SPF級)，每日觀察瘤結節生長及轉移情況，接種23 d后處死動物。

5. 細胞、組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色: 腫瘤細胞傳到第14代時，當腫瘤細胞長滿瓶壁80%時，用0.25%胰酶消化后計數，調整細胞數為1×105/ml后接種于含蓋玻片的六孔板中，放入CO2孵箱培養一段時間(約2～3 d)后取出長有腫瘤細胞的蓋玻片，然后按HE染色步驟做肺腺癌細胞HE染色；異種移植物分離后按組織切片HE染色步驟行肺腺癌組織HE染色。

結 果

一、原代及傳代培養

細胞在含10%FBS的RPMI 1640培養基中貼壁生長，鏡下見細胞為多邊形或類圓形，極少數為梭行，呈細胞團樣；細胞按1︰3傳代，每2～3 d傳代一次。現已經在體外培養8個月，傳至40余代，目前細胞生長旺盛，狀態良好，不依賴細胞生長因子維持生長，經液氮罐或-80 ℃低溫冰箱反復凍存復蘇后仍保持良好的增殖活性，復蘇細胞經0.4%胎盤藍染色，活細胞比率均保持在85%以上。

二、形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察活細胞體積較大，多為類圓形貼壁生長，呈腺腔樣排列，細胞接觸抑制消失，重疊現象明顯，見圖1；HE染色見細胞核大、偏位、深染，圓形或橢圓形，染色質粗、不均勻，核仁明顯、病理性核分裂象，核漿比例增大、倒置，胞漿內見豐富顆粒及空泡。符合肺腺癌細胞的特征，見圖2。

圖1 肺腺癌H114細胞形態(A、B圖10×10；C、D圖10×20)

圖2 肺腺癌H114細胞HE染色(A:10×20；B:10×40；C：10×63)

三、MTT比色法檢測肺腺癌H114細胞生長曲線

從細胞體外生長曲線可見：在整個168 h的觀察時間里，肺腺癌H114細胞始終處于持續增殖狀態，可見潛伏期和指數生長期，由于本細胞系傳代次數較少，生長活躍，7 d還沒出現平頂期和退化衰亡期，見圖3。第24～96小時(潛伏期)，生長曲線斜率很小，緩慢上升，說明細胞增殖比較緩慢；第96～168小時(指數生長期)，生長曲線斜率較大，上升走勢明顯，說明增殖加快。

四、異種移植

采用斷頭處死裸小鼠后鈍性分離左、右側腫塊，腫塊重約0.40 g，大小約1.0 cm×0.9 cm×0.8 cm。肉眼觀腫塊呈魚肉色，為圓形或類圓形，結節狀，切面灰白，質稍硬。解剖裸小鼠未查見遠處臟器轉移灶，見圖4。

五、組織切片HE染色

光鏡下見腫瘤細胞呈巢狀排列，細胞核大，核仁明顯，病理性核分裂相多見，核漿比例增大，胞漿內見豐富顆粒及空泡，伴局灶性壞死，腫瘤細胞向周圍肌肉及脂肪組織浸潤，伴有炎性細胞浸潤及纖維組織反應性增生，局部見壞死組織。符合肺腺癌細胞的特征，見圖5。

圖3 肺腺癌H114細胞生長曲線

圖4 裸鼠成瘤及瘤結節

注：A：10×10；B：10×20；C：10×40

討 論

腫瘤細胞對化療藥物的敏感性有明顯的個體差異，同一種腫瘤的不同類型或同一類型的不同個體，甚至同一個體在疾病的不同階段，其對化療藥物的反應性也不同，這些都是由于腫瘤異質性導致的。那什么是腫瘤異質性呢？腫瘤在生長、分裂、增殖過程中，由于子細胞在分子生物學或基因方面發生改變，使腫瘤的生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性及預后等各方面產生差異稱為腫瘤異質性，它是惡性腫瘤的特征之一。腫瘤異質性包括時間異質性、空間異質性、結構異質性、基因異質性、功能異質性和人為異質性[4]。此外，Brammer等[5]提出了位置異質性，他們發現肺外小細胞肺癌的預后與生長的部位密切相關，即解剖位置預測了腫瘤的生存期。并提出腫瘤位置的異質性可能對少見疾病的預后有影響。Crockford等[6]研究發現腫瘤不同的基因表達、不同的體細胞突變、腫瘤特異性的遺傳特征和微環境的選擇壓力對成功預測治療療效有指示作用。由于腫瘤異質性的存在，使Forbes等[7]的溶腫瘤病毒的三期臨床實驗失敗。這些研究都表明，腫瘤的異質性對腫瘤的治療、預后有極重要的預測作用。因此，建立我國特有的肺腺癌細胞系對研究我國肺腺癌的發病機制、治療、耐藥、預后有重大意義。

目前，國內外已建立了許多肺癌細胞系，但由于腫瘤的異質性、多態性和復雜性，不同種族、國家及地區來源的同一種組織類型的腫瘤，其細胞的生物學特性也不相同。本研究建立了我國發病率及病死率都位居國內首位的肺癌細胞系，進一步豐富了我國肺癌細胞系的類型[8-10]。而且，體外培養、建立的國人肺癌細胞系對于針對性、個體化研究我國人群肺癌癌變、侵襲轉移、能量代謝、多藥耐藥、生物學特征以及研發抗癌新藥等方面均有十分重要的理論和臨床意義[11-12]。

H114細胞系來源于重慶市永川區一男性肺腺癌患者的胸腔積液，腫瘤組織經臨床病理診斷為右上肺中-高分化管狀腺癌。在體外培養過程中，腫瘤細胞呈鑲嵌或腺泡樣排列，重疊性生長，異型性明顯，分裂指數高。細胞HE染色見腫瘤細胞體積大，核漿比例失調，細胞漿染色改變，出現空泡，核大，核畸形怪狀，染色深，見較多病理性核分裂相。MTT法測得的生長增殖曲線證明該細胞具有持續增值特性，這些均符合肺腺癌細胞的特點。異種移植實驗和組織HE染色表明H114細胞是肺腺癌細胞，與培養前的組織類型、分化程度相似。以上結果證明，本研究建立了一株新的肺腺癌細胞系。

參 考 文 獻

1 錢桂生. 肺癌不同病理類型發病率的變化情況及原因[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2011, 4(1): 1-6.

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3 司徒鎮強, 吳軍正. 細胞培養[M]. 第1版. 西安: 興界圖書出版公司, 2004: 65.

4 紀小龍. 腫瘤異質性的臨床意義[J]. 北京軍區醫藥, 2000, 12(1): 21-23.

5 Brammer JE, Lulla P, Lynch GR. Retrospective review of extra-pulmonary small cell carcinoma and prognostic factors[J]. Int J Clin Oncol, 2013, DOI 10.1007/s10147-013-0626-6.

6 Crockford A, Jamal-Hanjani M, Hicks J. Implications of intratumour heterogeneity for treatment stratification[J]. J Pathol, 2014, 232(2): 264-273.

7 Forbes NE, Abdelbary H, Lupien M, et al. Exploiting tumor epigenetics to improve oncolytic virotherapy[J]. Front Genet, 2013, 4: 184-195.

8 顏秉陽, 殷國強, 張志培, 等. 肺腺癌胸水腫瘤細胞分離與體外懸浮培養及鑒定[J]. 現代腫瘤醫學, 2012, 20(9): 1844-1848.

9 高全立, 汪 萍. 小細胞肺癌干細胞樣細胞的分離鑒定[J]. 中國癌癥雜志, 2010, 20(6): 421-426.

10 孫藝華, 李 立, 潘 俊, 等. p53-/-, k-ras基因型小鼠肺癌細胞株的建立與鑒定[J]. 中國癌癥雜志, 2009, 19(5): 335-339.

11 周清華. 肺癌新理論與新技術進展[M]. 第1版. 成都: 四川大學出版社, 2003: 31-65.

12 張 燕, 孫耕耘. 惡性胸腔積液的臨床診斷及治療進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2013, 6(1): 81-84.