蛋白激酶SPAK在海水淹溺性肺損傷中的表達和作用

李聰聰 薄麗艷 劉慶晴 劉 偉 金發(fā)光

淹溺每年造成了大量的人員傷亡，尤其以兒童和青少年為多，是亟待解決的公共安全問題[1]。而在淹溺造成的損傷中尤其以海水淹溺為重，除直接造成受害者死亡外，還極易引起急性肺損傷(acute lung injury, ALI)[2]。目前的研究表明，海水造成的淹溺性肺損傷之所以比淡水嚴重，與其較高的滲透壓密切相關[2]。這也為海水淹溺性肺損傷指出了一個可能的研究方向。

STE20相關脯氨酸丙氨酸豐富的蛋白激酶(STE 20/SPS1-related praline/alaninerich kinase, SPAK)屬于STE20激酶家族，與細胞膜上的離子共同轉運體相互作用，參與了鹽運輸和滲透細胞體積的調控[3]。SPAK參與了細胞對滲透壓調節(jié)的信號傳導，在高滲刺激的情況下SPAK表達上調，繼而可以通過激活p38通路，從而參與高滲刺激時的炎癥反應[4]。

本研究通過復制大鼠的海水淹溺性肺損傷(SWD/ALI)模型，觀察肺組織SPAK表達的變化，繼而探討SPAK的作用。

材料與方法

一、實驗材料

抗SPAK39(Origene，美國)，抗β-actin 單克隆抗體(安博，中國)，RNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)，TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒購買于R&D。

配方海水按照中國國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水的主要成分配制：NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，NaHCO30.202 g/L，KCl 0.725 g/L，NaBr 0.083 g/L；pH 8.2，相對密度1.05，滲透壓1300 mmol/L。

二、實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠30只，清潔級，體質量180～220 g，由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供。動物分為5組：對照組，海水處理1 h組，海水處理3 h組，海水處理6 h組，海水處理12 h組，每組6只。

三、實驗方法

1.動物模型的制備：用3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后將其仰臥固定，經頸正中切口暴露氣管，取1 ml的注射器插入氣管，緩慢注入4ml/kg海水。大鼠在注入海水之后迅速出現(xiàn)呼吸加快，喘息，耳鼻發(fā)紺，全肺滿布濕啰音，有粉紅色泡沫液體從口鼻流出，表明海水淹溺肺損傷模型復制成功。在海水吸入后相應時間點經腹主動脈放血處死大鼠，迅速取出肺組織。正常組麻醉后直接放血處死大鼠取肺。

2.肺組織病理檢測：取各組大鼠肺組織相同部位迅速放入4%多聚甲醛液中固定，脫水，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，然后用蘇木精-伊(hematoxylin-eosin, HE)染色，光學顯微鏡觀察。

3.肺組織濕干比(W/D)檢測：在吸入海水相應時間點放血處死大鼠，迅速取出各大鼠相同位置的肺組織，吸干表面的液體后在電子天平稱取重量即為濕重。將肺組織置于70 ℃烘箱內烘烤至恒重后秤取的重量即為干重。用濕重/干重計算所得即為濕干比，用以表示肺水腫嚴重程度。

4. ELISA檢測TNF-α和IL-1β：將適量肺組織加入PBS緩沖液，剪碎并用勻漿器將肺組織冰上充分勻漿，在4 ℃以離心半徑8 cm，3000 r/min離心20 min左右，收集上清液，然后按試劑盒說明書進行檢測。

5.RT-PCR檢測SPAK mRNA表達：取100 mg肺組織加入1 ml Trizol，冰上充分勻漿裂解，用紫外分光度計定量，根據(jù)定量結果進行反轉cDNA，-20 ℃保存。取適量的cDNA，加入Tap聚合酶，去離子水和引物進行擴增，以β-actin作為內參照。SPAK上游引物5′ATGGCGGAGCCGAGCGGCTCG-3′，下游引物5′ TCAGCTCACACTCAACTGGGCGAAC-3′；β-actin上游引物5′ACGGTCAGGTCATCACTATCGG3′，下游引物5′GCACTGTGTTGGCATAGAGGTC3′。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 72 ℃ 7 min，最后4 ℃保存，其中變性，退火，延伸設置30個循環(huán)。

6.Western-blot檢測SPAK蛋白表達：取適量的肺組織，在事先準備好的碎冰上剪碎肺組織，加入蛋白裂解液勻漿，離心收集上清，定量，沸水煮15 min，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以半干轉膜的方式將電泳完成的聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質分子轉移到NC膜上。將已做好標記的膜放入10%的脫脂奶粉封閉液中，于室溫緩慢振蕩2 h以封閉非特異性結合位點；一抗以 1︰1000稀釋，4 ℃搖床震蕩過夜，TBST洗膜；加入堿性磷酸酶標記的羊抗兔，37 ℃溫育2 h，再次TBST洗滌；將膜在暗室滴上發(fā)光液，避光保存并照相，結果做灰度掃描分析。

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、肺組織濕干比

經氣管海水灌注后，肺的W/D較正常組顯著升高，尤其以1 h為重。隨著時間的延長而逐漸降低，見表1。

表1 肺的濕干比檢測結果

二、肺組織的病理學改變

光學顯微鏡下見正常組肺組織，肺泡結構完整清晰，肺泡腔未見明顯的炎細胞和液體滲出。海水淹溺組可見肺組織結構破壞，肺泡壁增厚，肺泡腔被壓縮、變窄，有大量的炎細胞及液體的滲出，呈嚴重水腫，見圖1。

圖1 肺組織的病理學檢測結果

三、海水淹溺對肺組織TNF-α和IL-1β的影響

海水淹溺3 h、6 h后與對照組相比，TNF-α和IL-1β的水平明顯增高(P<0.05)，隨后炎癥因子的表達開始逐漸降低，見圖2。

注：**P<0.01,*P<0.05 vs. 正常組；# P<0.05, ##P<0.01 vs. 海水6 h組

四、海水淹溺對肺組織SPAK mRNA的影響

采用RT-PCR方法檢測肺組織中SPAK的mRNA含量變化，結果顯示海水刺激后肺組織中SPAK的mRNA含量明顯增加(P<0.05)，見圖3。

五、海水淹溺對肺組織SPAK蛋白含量的影響

采用western blot方法檢測肺組織勻漿中的SPAK蛋白的含量，顯示海水淹溺組的SPAK蛋白含量比對照組顯著增高(P<0.05)，見圖3。

注：**P<0.01,*P<0.05 vs. 正常組

討 論

高滲是海水淹溺主要的致傷因素，它可以通過在肺的血氣屏障中形成濃度梯度，從而使肺組織和微血管中的大量液體滲出到肺泡，形成嚴重的肺水腫[5-6]。此外海水的高滲可以作為一種刺激，對微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及細胞內某些蛋白的轉錄翻譯產生影響，從而形成海水淹溺性肺損傷獨特的病理生理改變。如何發(fā)現(xiàn)這些獨特的改變，以及了解這些改變對人體產生的影響，并通過對其進行干預，從而阻止病情的進一步發(fā)展有著重要的意義。

SPAK是STE20激酶家族的一個新的成員，它主要的生理作用是通過調節(jié)細胞膜上的離子轉運體，維持血壓的穩(wěn)定，它也是一個高血壓的獨立危險因素?，F(xiàn)階段對SPAK的研究大部分集中在其對鈉鉀氯共同轉運體(Na+-K+-2Cl-cotransporter, NKCC)磷酸化的調節(jié)[7]。在高滲或炎癥因子如TNF-α刺激下，SPAK表達升高，促進NKCC的磷酸化。但是SPAK的作用并不止這些，它與炎癥的發(fā)生發(fā)展也有著密切的聯(lián)系。SPAK也可以通過激活p38通路，從而參與炎癥反應[4]。在Crohn病等炎性腸病的研究中發(fā)現(xiàn)SPAK的表達同樣是升高的，通過siRNA干擾SPAK，可以降低腸上皮CaCo2-BEE細胞TNF-α, IL-1β, IL-17的分泌，從而降低組織的炎癥反應[8]。而且siRNA干擾SPAK表達后，腸上皮的通透性可降低，表明SPAK對上皮細胞的屏障功能起調控作用[9]。有文獻報道SPAK的這種作用可能是通過對細胞間緊密連接蛋白Occludin表達的調控而起作用的。其下游的NKCC與上皮細胞的通透性也有聯(lián)系,有文獻稱NKCC表達的升高可以使肺泡上皮細胞的通透性升高，從而加重肺損傷[7]。由此可見SPAK在炎癥及調節(jié)細胞的屏障功能中起著重要的作用。

本實驗顯示，在海水刺激后肺水腫及相關的炎癥因子明顯高于正常對照組。肺的濕干比以灌注后1 h為重，隨著時間的變化逐漸降低。而肺部的炎癥因子的含量則是逐漸升高，在3～6 h時達到頂峰。而后通過RT-PCR及western blot方法檢測肺組織勻漿中的SPAK含量的變化，提示在海水的刺激下，細胞通過上調SPAK的轉錄及翻譯來調節(jié)SPAK的含量及下游的相關分子的磷酸化，繼而加重肺的急性損傷。

綜上所述，本實驗通過復制大鼠海水淹溺性肺損傷模型，表明在海水高滲透壓的刺激下，細胞通過轉錄和翻譯上調SPAK的表達，參與肺的炎癥反應，加重了急性肺損傷的程度。本研究的結果指出了新的海水淹溺性肺損傷產生的機制，但是其確切的作用有待進一步的研究證實。

參 考 文 獻

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2 楊 昱, 王關嵩, 鄧朝霞, 等. 海水淹溺型肺損傷與淡水淹溺型肺損傷特征的比較[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2009, 34(4): 393-396.

3 Gagnon KB, Delpire E. Molecular physiology of SPAK and OSR1: two Ste20-related protein kinases regulating ion transport[J]. Physiol Rev, 2012,92(4):1577-1617.

4 Johnston AM, Naselli G, Gonez LJ, et al. SPAK, a STE20/SPS1-related kinase that activates the p38 pathway[J]. Oncogene, 2000, 19(37): 4290-4297.

5 Folkesson HG, Kheradmand F, Matthay MA. The effect of salt water on alveolar epithelial barrier function[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1994, 150(6 Pt 1): 1555-1563.

6 李佳歡, 許 敏, 金發(fā)光. 海水淹溺性肺損傷中肺水腫發(fā)生機制的研究進展[J]. 國際呼吸雜志, 2010, 30(14): 877-880.

7 Nguyen M, Pace AJ, Koller BH. Mice lacking NKCC1 are protected from development of bacteremia and hypothermic sepsis secondary to bacterial pneumonia[J]. J Exp Med, 2007, 204(6): 1383-1393.

8 Yan Y, Laroui H, Ingersoll SA, et al. Overexpression of Ste20-related proline/alanine-rich kinase exacerbates experimental colitis in mice[J]. J Immunol, 2011, 187(3): 1496-1505.

9 Yan Y, Dalmasso G, Nguyen HT, et al. Ste20-related proline/alanine-rich kinase (SPAK) regulated transcriptionally by hyperosmolarity is involved in intestinal barrier function[J]. PLoS One, 2009, 4(4): e5049.