Isthmin對博來霉素誘導肺纖維化小鼠膠原沉積及血管生成的影響

楊雪梅 陳魁君 謝 芳 王建民

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一組以肺泡上皮損傷、肺實質彌漫性炎性浸潤、成纖維細胞異常增殖以及細胞外基質過度沉積為主要特征的一大組疾病，目前發病機制仍不清楚，缺乏特效治療手段，預后很差[1]。有研究認為促纖維化/抗纖維化因子失調以及促炎/抗炎因子失調在特發性肺纖維化中起重要作用。然而針對轉化生長因子-β1(transforming growth factor, TGF-β1)、干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等抑制促纖維化/促炎因子以減輕肺纖維化的措施被證明效果不佳[2-3]。機制不清楚。

Isthmin(ISM)最早是從后腦組織中鑒定出的一種相對分子量為60×103的分泌性蛋白，最初被證實與神經系統發育相關，在腦、肺等臟器中均有表達[4-5]。我們在前期的實驗中發現Isthmin蛋白在肺纖維化模型小鼠中表達降低，且小鼠對10 μg/kg劑量的重組Isthmin蛋白耐受性較好，可能在肺纖維化的病理進程中發揮了作用。本實驗采用博來霉素(bleconmycin, BLM)復制小鼠肺纖維化模型，應用重組Isthmin蛋白進行干預，觀察肺纖維化程度、膠原沉積、血管生成等，旨在探討Isthmin蛋白是否可能作為防治肺纖維化新的治療靶標。

材料與方法

一、 實驗材料

昆明小鼠由第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供，體重30±2.5 g；重組小鼠Isthmin蛋白(貨號：577502，BioLegend公司)；鹽酸博來霉素(日本化藥株式會社，批號：H20055883)；CD31抗體(貨號：CBL1337，BD BioSciences公司)；免疫組化試劑盒(博士德生物工程有限公司，貨號：SA1022)。

二、實驗方法

1. 肺纖維化模型復制方法：實驗小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥固定于操作板，消毒頸部皮膚并做一小切口，逐層分離暴露氣管，由氣管軟骨間隙進針，沿向心方向緩慢注入博來霉素溶液5 mg/kg或等體積生理鹽水(0.9%NS)，氣管注藥完畢后立即將動物置于直立體位，并左右旋轉，使藥液盡量均勻分布于肺內，逐層縫合手術切口[6]。

2. 分組：取健康的昆明小鼠48只隨機分為三組，每組16只：對照組(氣管內注射0.9%NS+尾靜脈注入0.9%NS)、模型組(氣管內注射BLM+尾靜脈注入0.9%NS)、ISM組(氣管內注射BLM+尾靜脈注入ISM蛋白)。在手術后0 h、24 h、48 h對照組及模型組分別由尾靜脈注入0.9%NS 60 μl，ISM組則注入ISM蛋白10 μg/kg。手術后分別于第7、14、21、28天各取4只小鼠肺組織進行指標檢測。

3. 標本采集及肺組織病理學觀察：小鼠腹腔麻醉、局部消毒后沿胸骨剪開胸壁，充分暴露胸腔，觀察大體病理變化。右心室插管，以10%甲醛行肺血管灌注，至左心房流出液顏色澄清后，結扎氣管，游離雙肺，取右肺石蠟包埋切片。行常規蘇木精-伊紅染色(HE)、Masson染色，光學顯微鏡下觀察。血管數目采用CD31免疫組化染色法，CD31抗體濃度為1︰100。PBS代替一抗作為陰性對照。

4. 圖像分析：應用Image-Pro Plus6.0對圖像進行處理。每張切片隨機選取10個視野進行分析，自動計算光密度值，平均光密度值用于各組間比較。

三、統計學方法

結 果

一、肺大體病理觀察

對照組小鼠除第一周肺組織輕度腫脹，其余時間點肺表面呈粉紅色，肉眼未見病變。模型組小鼠各時間點肺表面均可見散在點狀至片狀暗紅色病變，以下肺尤其右下肺為多。ISM組各時間點亦可見表面散在點狀至片狀暗紅色病變，但與模型組比較，病變數目相對較少，病變面積也較小。

二、病理組織學改變

對照組在第7天可見部分肺泡壁有少量炎細胞浸潤，大部分肺泡壁正常，肺泡腔無縮小，在第14天、21天、28天，肺泡壁炎細胞浸潤消失，肺部未見明顯病理改變。模型組在第7天即可見大量炎細胞浸潤，肺泡結構紊亂，第14天炎癥最為顯著，21天及28天見炎細胞浸潤逐漸減輕，但肺泡壁增厚，肺泡腔縮小，纖維細胞數目增多。ISM組的病理表現與模型組相似，但無論第7天的炎細胞浸潤還是隨后各時間點的肺泡間隔增寬程度均較模型組輕，肺泡間隔中纖維細胞數目也較模型組少，見圖1。

三、ISM對肺組織膠原表達的影響

膠原纖維經Masson染色在光鏡下呈藍色。正常肺組織肺泡間隔膠原纖維較少，而纖維化的肺組織肺泡間隔見大量膠原纖維沉積。通過對各時間點肺組織Masson染色圖片比較可見在早期炎癥階段，膠原沉積開始增加，在后期的纖維化階段，大量膠原纖維沉積，肺泡間隔幾乎被藍色膠原纖維充填。而在Isthmin蛋白干預后，雖然在第7天及14天的炎癥階段，肺組織膠原沉積與模型組差別不大，但在自21 d以后的纖維化階段，肺泡間隔中膠原沉積較模型組明顯減少，見圖2。經圖像分析，模型組各時間點膠原沉積較對照組顯著增加(P<0.01)。Isthmin干預組與模型組比較，第21天、28天膠原沉積顯著降低(P<0.01)。表明Isthmin蛋白可降低博來霉素引起的膠原表達增加，見表1。

四、ISM對肺組織血管內皮細胞數量的影響：

在對照組，血管內皮細胞在肺泡壁散在分布，數量較少，著色較淺。模型組血管內皮細胞數量增多，細胞呈棕染較深，與對照組相比，差異顯著(P<0.05)。Isthmin蛋白干預后，在后期肺纖維化階段，血管內皮細胞數目顯著增加(P<0.05)，見圖3、表2。

表1 肺組織膠原纖維Masson染色MOD值比較

表2 肺組織CD31蛋白MOD值比較

圖1 各組肺組織不同時間病理變化(×200)

圖2 肺組織Masson染色(×200)

注：內皮細胞染色陽性，呈棕色改變。對照組(NS+NS)；模型組(BLM+NS)；Isthmin干預組(BLM+ISM)

討 論

肺纖維化是呼吸系統難治性疾病之一，以成纖維細胞增殖和大量細胞外基質(extracellular matrix, ECM) 聚集為主要特征的病變。由于肺間質的廣泛纖維化，使肺順應性降低，肺容量減少，彌散功能降低，通氣/血流比例失調。臨床表現為刺激性干咳、無痰、進行性的呼吸困難及活動后明顯加重等。病程一般呈進行性發展，最終可以引起呼吸功能衰竭而死亡，其5年生存率不超過50%，因此目前引起許多國內外學者的關注[7-10]。但迄今肺纖維化的病因及其發病機制尚未完全闡明。

近年來血管生成在肺纖維化發生中的作用日益受到重視。新近的研究進一步發現，血管生成活性的增加歸咎于促血管生成和抗血管生成的失衡，促血管生成因素增加，肺纖維化模型新生血管增多與博萊霉素誘發的肺纖維化密切相關。這些研究表明異常的血管重構可能在IPF的發生中起重要作用。我們的研究也證實肺纖維化模型小鼠的肺組織確實存在肺血管內皮數目增多，提示血管生成增加[3, 11-12]。血管生成的異常增加可能參與了肺纖維化的發生發展過程。

Isthmin蛋白的中部具有凝血栓蛋白的type 1重復序列(thrombospondin type 1 repeat)，C末段具有黏附相關蛋白區域，TSR在分泌性或跨膜性蛋白中存在，其功能與細胞黏附、通訊和組織重建相關[4, 13]。Isthmin蛋白是一種血管生成抑制分子，可以負反饋的調節VEGF 誘導的血管生成，在體外具有誘導內皮細胞凋亡、抑制新生血管形成的作用[5, 14-15]。本研究用Isthmin蛋白注入肺纖維化模型小鼠體內，結果顯示在一定程度上減輕了肺纖維化早期的炎癥反應及肺纖維化后期的膠原沉積， 尤其以減少膠原沉積的作用最為顯著，表明Isthmin蛋白對肺纖維化有一定的防治作用。根據目前對Isthmin蛋白功能的研究結果，推測Isthmin蛋白抑制肺纖維化的進展可能與抑制血管生成有關。出乎意料的是，肺組織血管內皮染色卻顯示注入Isthmin蛋白后，與注射生理鹽水比較，模型小鼠肺血管內皮細胞數目不僅沒有減少，反倒有所增加。這提示Isthmin蛋白抑制肺纖維化形成的作用可能不是通過抑制血管生成的途徑實現的。本研究關于Isthmin蛋白的體內實驗并沒有如文獻報道的體外實驗一樣，有抑制血管生成的作用，提示Isthmin蛋白還具有除抑制血管生成之外的其他作用。其具體的細胞分子機制有待更深入的研究。無論Isthmin蛋白的具體作用機制如何，在我們的實驗中，它確實具有減輕博來霉素刺激產生肺纖維化病情程度的作用，可望成為防治肺纖維化的新藥物。

參 考 文 獻

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3 Farkas L, Gauldie J, Voelkel NF, et al. Pulmonary hypertension and idiopathic pulmonary fibrosis: a tale of angiogenesis, apoptosis, and growth factors[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2011, 45(1): 1-15.

4 Rossi V, Beffagna G, Rampazzo A, et al. TAIL1: an isthmin-like gene, containing type 1 thrombospondin-repeat and AMOP domain, mapped to ARVD1 critical region[J]. Gene, 2004, 335: 101-108.

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