高效液相色譜法測定環吡酮胺乳膏中藥物的含量及其體外透皮釋放量的研究

方嬈瑩+鐘世順+葉秀金+黃竹航

【摘要】目的探討環吡酮胺乳膏應用高效液相色譜法進行藥物含量與體外透皮釋放量測定的效果。方法檢測波長305 nm；流動相：乙腈-0.1%乙二胺四醋酸二鈉溶液(70:30)；Kromasil C18色譜柱；應用單室Franz擴散池、大鼠腹皮進行透皮釋放實驗, 對比市面乳膏與自制乳膏的透皮結果。結果環吡酮胺范圍介于20~180 μg/mL間, 平均回收率99.8%, RSD為0.70%, 線性關系較好(r=0.9997), 相關因素為0.9673, 市面乳膏與自制乳膏透皮結果差異無統計學意義(P>0.05)。結論采用高效液相色譜法測定環吡酮胺乳膏不會受皮膚成分與軟膏基質影響, 且操作簡便, 準確率高, 測定效果理想。

【關鍵詞】環吡酮胺；高效液相色譜法；體外透皮釋放；藥物；測定

Research on high performance liquid chromatography method for the determination of drugs in ciclopirox olamine cream and its in vitro transdermal release quantityFANG Rao-ying, ZHONG Shi-shun, YE Xiu-jin, et al. Guangdong Institute of Biological Products and Drugs, Guangzhou 510440, China

【Abstract】Objective To determinate content of drugs in ciclopirox olamine cream by high performance liquid chromatography method(HPLC) and its in vitro transdermal release. Methods Detection wavelength of 305 nm; mobile phase: acetonitrile -0.1% four acetic acid disodium ethylenediamine solution(70-30); Kromasil C18 chromatographic column; application of single chamber Franz diffusion pool, big abdomen skin transdermal release experiments, contrasted the transdermal cream with homemade cream market results. Results Ciclopirox olamine cream range between 20~180 μg/ml, the average recovery was 99.8%, RSD was 0.70%, had good linear relationship (r=0.9997), and related factors 0.9673, cream market and the results of the homemade cream transdermal no statistical significance(P>0.05). Conclusion By high performance liquid chromatography determination of ciclopirox olamine cream wont be affected by the composition of the skin with cream base with easy operation, high accuracy, ideal measurement effect.

【Key words】Ciclopirox olamine cream; High performance liquid chromatography; In vitro transdermal release; Drugs; Determination

環吡酮胺乳膏(ciclopirox olamine ointment)作為一種廣譜抗真菌藥物, 其通過阻斷真菌細胞對鉀離子、蛋白質前體物質及其他物質的攝取, 從而導致真菌因缺乏營養來源而死亡, 具有極高滲透性, 可對霉菌、皮膚癬菌、酵母菌及其他真菌產生較強的抗菌活性作用［1］。高效液相色譜法作為色譜法的主要分支之一, 以其高效、高靈敏度、高壓、范圍廣與分析速度快等特點成為近年來化學、醫學、工業、農學等學科領域的重要分離分析試驗技術［2］。本文應用高效液相色譜法對環吡酮胺乳膏藥物含量及體外透皮釋放量進行測定, 成功使樣品分離, 結果較為理想。現報告如下。

1儀器與試藥

1. 1儀器本次測定選取高效液相色譜儀(SPECTRA SYSTEM P1000, 美國熱電集團TSP公司)；紫外檢測器(SPECTRA SYSTEM UV1000, 美國熱電集團TSP公司)；TK-12A型透皮擴散試驗儀(擴散面積3 cm2, 磁力攪拌速度300 r/min, 接收池體積7 ml3)。

1. 2試藥環吡酮胺乳膏{批號:052001, 052002, 052003, 湖北科益藥業股份有限公司, 國藥準字H10890061, Loproxcream［聯邦德國藥廠(HoechestAG E.R.G)］, 10 g/支}；環吡酮胺對照品(批號:100232-200201, 中國藥品生物制品檢定所)。

2方法及結果

2. 1藥物含量測定

2. 1. 1配制溶液供試品溶液：精密稱取批號052001, 052002, 052003環吡酮胺乳膏各10 g置入燒杯, 添加甲醇25 ml, 應用溫水浴加熱溶解, 再置于冷水浴內冷卻, 濾過, 而后以同法行3次提取, 濾液合并后置入100 ml容量瓶內, 以甲醇定容, 蓋塞, 翻轉搖勻, 取得供試品溶液。

2. 1. 2線性關系定容精密稱取對照品25 mg置入50 ml量瓶中, 加甲醇溶解、搖勻后, 加甲醇定容至刻度；分別精吸1、3、5、7、9 ml置入25 ml量瓶中, 再次定容搖勻, 用注射器從5個量瓶中分別精密吸取20 μl注入液相色譜儀, 記錄色譜圖, 以峰面積對濃度行線性回歸, 回歸方程為A=-55657+9522C, r=0.9997。結果顯示, 環吡酮胺線系關系較好, 范圍介于20~180 μg/ml之間。

2. 1. 3色譜條件Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×200 mm, 5 μm)；流速1.0 ml/min；進樣量20 μl；流動相：乙腈-0.1%乙二胺四醋酸二鈉溶液(70:30)；柱溫35℃；檢測波長305 nm。理論塔板數以環吡酮胺計>2000, 其余成分無干擾。

2. 1. 4穩定性、重復性及精密度實驗取對照品溶液持續進樣5次, 結果顯示環吡酮胺峰面積RSD為0.41%。根據“2.1.1”步驟配制供試品溶液, 按時間順序依次于0、1、3、5、7、9、11 h進樣, 結果顯示環吡酮胺峰面積RSD為1.05%(n=7), 證實在11 h內, 供試品溶液即可達到穩定狀態。另取9份同批樣品分別配制成供試品溶液, 經進樣測定, 環吡酮胺含量RSD為0.40%, 表明該測定方式具有較好重復性。

2. 1. 5統計學方法用SPSS18.0統計學軟件處理數據, 計數資料實施χ2檢驗, P<0.05表示差異有統計學意義。

2. 1. 6回收率試驗分別為9份0.5 g環吡酮胺乳膏添加適量對照品, 配制成高、中、低3種濃度的供試品溶液各3份, 再分別進行進樣測定, 結果顯示環吡酮胺平均回收率99.8%, RSD為0.70%。

2. 1. 7樣品含量測定取3批樣品, 批號分別為052001, 052002, 052003, 均配制成供試器溶液, 分別對供試器溶液與對環吡酮胺對照品溶液進行進樣測定, 3批樣品均根據外標法以峰面積計算其中環吡酮胺平均含量, 并結合2005年出版的《中華人民共和國藥典》［3］中關于環吡酮胺乳膏含量測定方法進行測定, 最終得出3批樣品環吡酮胺平均含量。詳情見表1。

表1高效液相色譜法與紫外吸收法樣品結果對比(%)

方法 052001 052001 052001

紫外吸收法 94.93 94.68 96.19

高效液相色譜法 95.03 94.42 95.67

注：P>0.05, 差異無統計學意義

2. 2體外透皮釋放量研究

2. 2. 1實驗方式首先將大鼠皮膚固定于擴散裝置的接受室與擴散室間, 將0.9%氯化鈉溶液注入接受室內, 令液面剛好碰觸皮膚內層, 而后將氣泡排除, 啟動攪拌器, 取2 g乳膏均勻涂抹于皮膚表皮, 而后每過1 h取樣7 ml, 再同時補充7 ml 0.9%氯化鈉溶液, 至8 h止, 利用0.8 μm微孔濾膜進行過濾, 從中取續濾液實行進樣測定, 藥物累積滲透量應用零級方程對時間數據擬合, 獲得直線斜率即透皮速率J。

2. 2. 2實驗結果市面乳膏：回歸曲線Q=41.03t-77.51, R=0.9652；透皮速率41.03 J, 8 h累積滲透量290.91 μg。自制乳膏：回歸曲線Q=42.95 T-77.83, R=0.9673；透皮速率42.95 J, 8 h累積滲透量306.42 μg。組間差異無統計學意義(P>0.05)。

3討論

《中華人民共和國藥典》中紫外分光光度法雖操作簡便, 但結果易受時間、溫度及濃度等因素的影響［4］, 而如表1所見, 本次測定中, 應用紫外吸收法與高效液相色譜法分別測定3批樣品, 結果差異無統計學意義(P>0.05), 證明高效液相色譜法不但可測定出環吡酮胺乳膏含量及相關物質, 還可作為鑒別藥物穩定性的可靠依據。另外, 經方法學考察, 顯示經皮滲透釋放液中雜質在以乙腈-0.1%乙二胺四醋酸二鈉溶液(70:30)為流動相的色譜條件下最不易對環吡酮胺色譜峰產生干擾, 可實現雜質色譜峰與主成分色譜峰的徹底分離, 且具有靈敏性高、專屬性強、操作方便快捷等特點, 適于測定環吡酮胺乳膏含量及其體外透皮釋放量。

實驗測量中, 累積滲透量(Q)對t1/2行線性回歸, 8份測定樣品R均為0.96以上, 表明累積滲透量(Q)與t1/2間存在較佳相關性, 環吡酮胺累積滲透量可隨時間推移而上升。結果顯示, 8份樣品的透皮速率、8 h累積滲透量及相關系數均呈平行, 證實該結果真實可信, 其不足之處是以大鼠腹皮作實驗, 與人體皮膚相比存在一定差距, 有待更深入研究。

參考文獻

［1］ 陳晶, 王京輝, 傅欣彤, 等. 高效液相色譜法測定銀杏葉提取物中4個酚酸類化合物的含量.藥物分析雜志, 2013, 33(05): 818-821.

［2］ 王益民. 環吡酮胺陰道栓微生物限度檢查方法學驗證.海峽藥學, 2012, 24(08):82-84.

［3］ 宋妍, 李瑩, 金立弟. HPLC法測定環吡酮胺搽劑的含量及其有關物質.中國藥師, 2013, 16(05):684-686.

［4］ 姚洪艷. HPLC法測定環吡酮胺乳膏的有關物質.黑龍江科技信息, 2012(34):36.

［收稿日期：2014-04-15］

2. 1. 5統計學方法用SPSS18.0統計學軟件處理數據, 計數資料實施χ2檢驗, P<0.05表示差異有統計學意義。

2. 1. 6回收率試驗分別為9份0.5 g環吡酮胺乳膏添加適量對照品, 配制成高、中、低3種濃度的供試品溶液各3份, 再分別進行進樣測定, 結果顯示環吡酮胺平均回收率99.8%, RSD為0.70%。

2. 1. 7樣品含量測定取3批樣品, 批號分別為052001, 052002, 052003, 均配制成供試器溶液, 分別對供試器溶液與對環吡酮胺對照品溶液進行進樣測定, 3批樣品均根據外標法以峰面積計算其中環吡酮胺平均含量, 并結合2005年出版的《中華人民共和國藥典》［3］中關于環吡酮胺乳膏含量測定方法進行測定, 最終得出3批樣品環吡酮胺平均含量。詳情見表1。

表1高效液相色譜法與紫外吸收法樣品結果對比(%)

方法 052001 052001 052001

紫外吸收法 94.93 94.68 96.19

高效液相色譜法 95.03 94.42 95.67

注：P>0.05, 差異無統計學意義

2. 2體外透皮釋放量研究

2. 2. 1實驗方式首先將大鼠皮膚固定于擴散裝置的接受室與擴散室間, 將0.9%氯化鈉溶液注入接受室內, 令液面剛好碰觸皮膚內層, 而后將氣泡排除, 啟動攪拌器, 取2 g乳膏均勻涂抹于皮膚表皮, 而后每過1 h取樣7 ml, 再同時補充7 ml 0.9%氯化鈉溶液, 至8 h止, 利用0.8 μm微孔濾膜進行過濾, 從中取續濾液實行進樣測定, 藥物累積滲透量應用零級方程對時間數據擬合, 獲得直線斜率即透皮速率J。

2. 2. 2實驗結果市面乳膏：回歸曲線Q=41.03t-77.51, R=0.9652；透皮速率41.03 J, 8 h累積滲透量290.91 μg。自制乳膏：回歸曲線Q=42.95 T-77.83, R=0.9673；透皮速率42.95 J, 8 h累積滲透量306.42 μg。組間差異無統計學意義(P>0.05)。

3討論

《中華人民共和國藥典》中紫外分光光度法雖操作簡便, 但結果易受時間、溫度及濃度等因素的影響［4］, 而如表1所見, 本次測定中, 應用紫外吸收法與高效液相色譜法分別測定3批樣品, 結果差異無統計學意義(P>0.05), 證明高效液相色譜法不但可測定出環吡酮胺乳膏含量及相關物質, 還可作為鑒別藥物穩定性的可靠依據。另外, 經方法學考察, 顯示經皮滲透釋放液中雜質在以乙腈-0.1%乙二胺四醋酸二鈉溶液(70:30)為流動相的色譜條件下最不易對環吡酮胺色譜峰產生干擾, 可實現雜質色譜峰與主成分色譜峰的徹底分離, 且具有靈敏性高、專屬性強、操作方便快捷等特點, 適于測定環吡酮胺乳膏含量及其體外透皮釋放量。

實驗測量中, 累積滲透量(Q)對t1/2行線性回歸, 8份測定樣品R均為0.96以上, 表明累積滲透量(Q)與t1/2間存在較佳相關性, 環吡酮胺累積滲透量可隨時間推移而上升。結果顯示, 8份樣品的透皮速率、8 h累積滲透量及相關系數均呈平行, 證實該結果真實可信, 其不足之處是以大鼠腹皮作實驗, 與人體皮膚相比存在一定差距, 有待更深入研究。

參考文獻

［1］ 陳晶, 王京輝, 傅欣彤, 等. 高效液相色譜法測定銀杏葉提取物中4個酚酸類化合物的含量.藥物分析雜志, 2013, 33(05): 818-821.

［2］ 王益民. 環吡酮胺陰道栓微生物限度檢查方法學驗證.海峽藥學, 2012, 24(08):82-84.

［3］ 宋妍, 李瑩, 金立弟. HPLC法測定環吡酮胺搽劑的含量及其有關物質.中國藥師, 2013, 16(05):684-686.

［4］ 姚洪艷. HPLC法測定環吡酮胺乳膏的有關物質.黑龍江科技信息, 2012(34):36.

［收稿日期：2014-04-15］

2. 1. 5統計學方法用SPSS18.0統計學軟件處理數據, 計數資料實施χ2檢驗, P<0.05表示差異有統計學意義。

2. 1. 6回收率試驗分別為9份0.5 g環吡酮胺乳膏添加適量對照品, 配制成高、中、低3種濃度的供試品溶液各3份, 再分別進行進樣測定, 結果顯示環吡酮胺平均回收率99.8%, RSD為0.70%。

2. 1. 7樣品含量測定取3批樣品, 批號分別為052001, 052002, 052003, 均配制成供試器溶液, 分別對供試器溶液與對環吡酮胺對照品溶液進行進樣測定, 3批樣品均根據外標法以峰面積計算其中環吡酮胺平均含量, 并結合2005年出版的《中華人民共和國藥典》［3］中關于環吡酮胺乳膏含量測定方法進行測定, 最終得出3批樣品環吡酮胺平均含量。詳情見表1。

表1高效液相色譜法與紫外吸收法樣品結果對比(%)

方法 052001 052001 052001

紫外吸收法 94.93 94.68 96.19

高效液相色譜法 95.03 94.42 95.67

注：P>0.05, 差異無統計學意義

2. 2體外透皮釋放量研究

2. 2. 1實驗方式首先將大鼠皮膚固定于擴散裝置的接受室與擴散室間, 將0.9%氯化鈉溶液注入接受室內, 令液面剛好碰觸皮膚內層, 而后將氣泡排除, 啟動攪拌器, 取2 g乳膏均勻涂抹于皮膚表皮, 而后每過1 h取樣7 ml, 再同時補充7 ml 0.9%氯化鈉溶液, 至8 h止, 利用0.8 μm微孔濾膜進行過濾, 從中取續濾液實行進樣測定, 藥物累積滲透量應用零級方程對時間數據擬合, 獲得直線斜率即透皮速率J。

2. 2. 2實驗結果市面乳膏：回歸曲線Q=41.03t-77.51, R=0.9652；透皮速率41.03 J, 8 h累積滲透量290.91 μg。自制乳膏：回歸曲線Q=42.95 T-77.83, R=0.9673；透皮速率42.95 J, 8 h累積滲透量306.42 μg。組間差異無統計學意義(P>0.05)。

3討論

《中華人民共和國藥典》中紫外分光光度法雖操作簡便, 但結果易受時間、溫度及濃度等因素的影響［4］, 而如表1所見, 本次測定中, 應用紫外吸收法與高效液相色譜法分別測定3批樣品, 結果差異無統計學意義(P>0.05), 證明高效液相色譜法不但可測定出環吡酮胺乳膏含量及相關物質, 還可作為鑒別藥物穩定性的可靠依據。另外, 經方法學考察, 顯示經皮滲透釋放液中雜質在以乙腈-0.1%乙二胺四醋酸二鈉溶液(70:30)為流動相的色譜條件下最不易對環吡酮胺色譜峰產生干擾, 可實現雜質色譜峰與主成分色譜峰的徹底分離, 且具有靈敏性高、專屬性強、操作方便快捷等特點, 適于測定環吡酮胺乳膏含量及其體外透皮釋放量。

實驗測量中, 累積滲透量(Q)對t1/2行線性回歸, 8份測定樣品R均為0.96以上, 表明累積滲透量(Q)與t1/2間存在較佳相關性, 環吡酮胺累積滲透量可隨時間推移而上升。結果顯示, 8份樣品的透皮速率、8 h累積滲透量及相關系數均呈平行, 證實該結果真實可信, 其不足之處是以大鼠腹皮作實驗, 與人體皮膚相比存在一定差距, 有待更深入研究。

參考文獻

［1］ 陳晶, 王京輝, 傅欣彤, 等. 高效液相色譜法測定銀杏葉提取物中4個酚酸類化合物的含量.藥物分析雜志, 2013, 33(05): 818-821.

［2］ 王益民. 環吡酮胺陰道栓微生物限度檢查方法學驗證.海峽藥學, 2012, 24(08):82-84.

［3］ 宋妍, 李瑩, 金立弟. HPLC法測定環吡酮胺搽劑的含量及其有關物質.中國藥師, 2013, 16(05):684-686.

［4］ 姚洪艷. HPLC法測定環吡酮胺乳膏的有關物質.黑龍江科技信息, 2012(34):36.

［收稿日期：2014-04-15］