吉西他濱對Beclinl基因沉默的人胰腺癌MiaPaCa-2細胞的周期及凋亡的影響

李宏宇 李曉姝 王立生 楊月峰 郭曉鐘

胰腺癌的發生、發展及轉移與其細胞生物學的調控有關，并與細胞壞死、凋亡及自噬存在密切聯系。Beclin1基因參與細胞自噬的調控，在腫瘤形成及發展過程中具有重要作用[1-3]。研究提示，胃癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞存在Beclin1自噬基因的缺陷，導致了腫瘤細胞逃避自噬性死亡，且發現某些抗腫瘤藥物可能通過自噬機制在腫瘤治療方面發揮作用，但在胰腺癌方面尚缺乏相關的研究報道。吉西他濱是目前用于治療胰腺癌的一線藥物。本研究觀察吉西他濱對Beclin1基因沉默的人胰腺癌細胞系MiaPaCa-2細胞周期及凋亡的影響，為胰腺癌的基因治療提供一定的實驗基礎。

材料與方法

一、質粒的構建及細胞轉染

根據siRNA設計原理，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成3條靶向Beclin1基因的siRNA(siBecl)、陰性對照siRNA(siNC)及熒光標記的siRNA(siFAM)。篩選干擾效果最好的siBecl序列構建表達質粒U6/Neo-siBec1、陰性對照質粒pGPU6/Neo-siNC及熒光對照質粒pGPU6/GFP/Neo-siFAM。載體由上海吉瑪制藥技術有限公司構建。

人胰腺癌細胞系MiaPaCa-2由軍事醫學科學院提供，常規條件下培養、傳代。取對數生長期細胞，采用Lipofectamin2000(Invitrogen 公司)將3種質粒分別轉染細胞。先瞬時轉染，48 h，再在培養上清液中加入400 μg/ml的G418篩選穩定轉染細胞，3～4 d，換含G418的培養液一次，18 d后收集細胞，提取蛋白，置-20℃冰箱保存。

此外，轉染siBecl的MiaPaCa-2細胞的培養液中加入0.4 μg/ml吉西他濱(法國禮來公司)繼續培養24 h，以未加吉西他濱處理的轉染siBecl的MiaPaCa-2細胞作為對照。

二、Beclin1蛋白和mRNA表達的檢測

采用常規蛋白質印跡法檢測Beclin1蛋白表達，以β-actin作為內參。兔抗Beclin1單抗為Reagents 公司產品，兔抗Actin抗體以及羊抗兔IgG多抗為Santa Cruz公司產品。

應用Trizol試劑盒(Invitrogen公司)提取各組細胞總RNA，按照試劑盒說明書操作。先逆轉錄成cDNA，再行實時PCR檢測Beclin1mRNA表達，RT-PCR試劑盒為Fermentas(中國)公司產品。根據GenBank的Beclin1基因上游調控區序列，由Invitrogen 公司合成Beclin1引物，上游序列5′-GGTGTCTCTCGCAGATTCATC-3′，下游序列5′-TCAGTCTTCGGCTGAGGTTCT-3′。 以β-actin作為內參。PCR反應條件：95℃ 2 min，95℃ 20 s、65℃ 20 s、72℃ 30 s，40個循環。60～90℃間每升溫0.2℃維持2 s。mRNA表達量通過公式2-ΔΔCt計算，以shNC轉染細胞的表達量為1.0。

三、細胞凋亡檢測

收集轉染后48 h的細胞至EP管，1 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清。加入1 ml預冷PBS，輕輕震蕩以懸浮細胞，1 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，重復2次。在各管中加200 μl Binding Buffer，輕輕吹懸，再各加入10 μl Annexin V-FITC(北京眾康志恒生物公司)，輕輕混勻，移至玻璃試管中，室溫避光反應15 min。加入300 μl Binding Buffer、10 μl PI，反應5 min后(1 h內)上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

四、細胞周期分析

收集轉染shBecl及shNC后48 h的細胞及經吉西他濱處理24 h的轉染shBecl的細胞至EP管，1 000 r/min 4℃離心10min，棄上清，同上法用預冷PBS洗滌細胞3次，加入70%乙醇(PBS稀釋)4℃固定24 h，1 000 r/min 4℃離心5 min后去上清，PBS洗2次，移至玻璃試管中，加入2 μl RNase(10 mg/ml)、0.5%的PI ，4℃避光20 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

五、統計學處理

結 果

一、細胞轉染效率

通過波長480 nm的藍光激發，FAM-siRNA在熒光顯微鏡下顯示為綠色熒光(圖1)。轉染率達75%。

圖1 FAM-siRNA轉染MiaPaCa-2細胞后6 h的光鏡(a)及熒光鏡(b)圖(×100)

二、轉染后細胞Beclin1蛋白和mRNA的表達

3條siBecl插入質粒后轉染MiaPaCa-2細胞，以轉染插入siBecl-3質粒的MiaPaCa-2細胞的Beclin1蛋白表達最低(圖2)，抑制效果最佳。后續實驗均取該質粒轉染的細胞進行。

圖2 陰性對照siRNA(1)及3條靶向Beclin1基因的siRNA(2、3、4)轉染MiaPaCa-2細胞48 h后Beclin1蛋白的表達

轉染siNC質粒細胞的Beclin1 mRNA表達量為1.0，轉染siBecl質粒細胞的Beclin1 mRNA表達量為0.295，表達明顯受到抑制(圖3)。

圖3 轉染siBecl質粒48 h后MiaPaCa-2細胞Beclin1 mRNA的表達

三、吉西他濱對Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2細胞周期的影響

轉染siBecl質粒的MiaPaCa-2細胞的S、G2期細胞數較轉染siNC質粒的MiaPaCa-2細胞減少，而G1期細胞增多(表1)。轉染siBecl質粒的MiaPaCa-2細胞經吉西他濱處理后，其S期細胞數較吉西他濱未處理的轉染siBecl質粒的MiaPaCa-2細胞進一步減少，而G1、G2期細胞增多(表1)。

四、吉西他濱對Beclin1 基因沉默的MiaPaCa-2細胞凋亡的影響

Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2細胞經吉西他濱處理后，細胞凋亡率被顯著抑制(0.06%比29.13%，P<0.01，圖4)。

圖4 轉染siNC(a)和轉染siBec1(b)細胞經吉西他濱處理后的凋亡細胞數

討 論

腫瘤的發生、發展是細胞無限增殖和凋亡受抑制的結果，自噬與凋亡之間存在著復雜的聯系，并參與腫瘤發生的調控。Beclinl主要通過與Ⅲ型PI3K形成復合體的途徑調節其他自噬相關蛋白在自噬前體結構中定位，從而調節自噬活性[4]。Beclin1有4個重要的結構域，它們分別與UVRAG、Vps34、Ambra1、Bcl-2蛋白形成復合體，其中Bcl-2與Beclin1的BH3結構域結合后對自噬起負性調節作用[5]。已有研究顯示，Beclin1與凋亡抑制因子Bcl-2相互發生作用，并與Bcl-2蛋白的拮抗因子Bax以及Bax相互作用因子-1(Bif-1)作用均可以促進細胞自噬，其中Bif-1通過UVRAG與Beclin1相互結合，正向調節PI3K通路。Beclin1基因缺失或Bif-1基因敲除后腫瘤的形成率顯著增高。自噬對于腫瘤凋亡究竟起促進作用還是抑制作用目前尚不清楚。本研究結果顯示，Beclin1基因沉默后MiaPaCa-2細胞的凋亡未受到明顯影響，提示可能存在更為復雜的調節機制。有研究顯示，處于G0、G1期的腫瘤細胞Bcl-2表達明顯增加，通過其抑制細胞凋亡而延長生存期，增加癌基因突變的可能性[6]。本研究也顯示，Beclin1基因沉默后明顯影響了腫瘤細胞的周期分布，但是否與Bcl-2的調節作用有關，有待于進一步研究證實。

表1 轉染siBecl及siNC的Mia PaCa-2細胞給于吉西他濱處理前后的細胞周期分布

吉西他濱是一種目前用于治療胰腺癌療效顯著的細胞周期特異性抗代謝類抗癌藥。它主要作用于DNA合成期(即S期)的腫瘤細胞，也可以阻斷細胞由G1期向S期進展。它在細胞內經核苷激酶轉化為具有活性的二磷酸鹽(dFdCDP)和三磷酸鹽(dFdCTP)，抑制DNA的合成。本研究結果顯示，吉西他濱處理Beclin1基因沉默的MiaPaCa-2細胞可導致細胞周期阻滯于S期，提示Beclin1的沉默可能影響了吉西他濱的正常生物學效應，即Beclin1可能有拮抗吉西他濱抑制胰腺癌細胞的生長作用。當然亦可能由于質粒中的序列片段影響了吉西他濱抑制腫瘤細胞DNA合成的途徑。雖然Beclin1基因沉默對MiaPaCa-2細胞的凋亡未產生影響，但卻明顯抑制了吉西他濱誘導的MiaPaCa-2細胞凋亡。Wen等[7]報道，自噬與Caspase依賴的細胞凋亡發生相關，Beclin1可通過增強Caspase-9的活性參與化療藥物CDDP誘導的人胃癌細胞MKN28的凋亡；腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配基TRAIL在人乳腺上皮細胞MCF-10A組織的形成過程中，誘導自噬形成也伴隨著Caspase依賴的細胞凋亡發生[8]。本基因中Beclin1抑制吉西他濱誘導的MiaPaCa-2細胞凋亡的機制是否可能通過Caspase途徑來實現尚需進一步研究。

參 考 文 獻

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[2] Amaravadi RK, Yu D, Lum JJ, et al. Autophagy inhibition enhances therapy-induced apoptosis in a Myc-induced model of lymphoma[J]. J Clin Invest, 2007, 117(2):326-336.

[3] Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J]. Nature, 2008, 451(7182):1069-1075.

[4] Meijer AJ, Codogno P. Regulation and role of autophagy in mammalian cells[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(12): 2445-2462.

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