腦源性神經營養因子在胰腺導管腺癌中的表達及其臨床意義

胡立威 陳炯 周杭城 楊仁保 陳龍江 趙躍

胰腺癌除高侵襲性及多重耐藥性外，胰周神經浸潤也是其一個顯著特征，發生率可達54%～100%[1]。文獻證實[2]，神經浸潤與患者臨床手術時機的選擇以及生存時間密切相關。因此，近年來越來越多的研究開始關注胰腺癌的神經浸潤機制。文獻報道[3-4]，胰腺內外神經組織產生的許多神經營養因子、黏附分子參與了胰腺癌的神經侵襲過程。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)自分泌表達于胃、胰實體腫瘤[4]，參與胰腺腫瘤的發生、增殖，癌細胞的轉移和神經浸潤[5-7]。本研究檢測胰腺導管腺癌組織中BDNF基因的表達，分析BDNF表達與胰腺癌病理參數之間的關系，探討其在胰腺癌發生、發展中的作用。

材料與方法

一、臨床資料

收集安徽省立醫院1991年8月至2012年12月外科手術切除的46例胰腺癌及38例胰腺良性疾病患者的資料。46例胰腺癌患者中男性24例，女性22例，年齡45～76歲，病理證實均為胰腺導管腺癌。38例胰腺良性疾病患者中男性21例，女性17例，年齡 41～65歲，包括13例急性胰腺炎、8例慢性胰腺炎、9例胰腺囊腫、1例胰腺導管內乳頭狀瘤，7例有胰管結石。另選取20例正常胰腺作為對照組，其中男性11例，女性9例，標本來源于尸體解剖、胰腺意外傷及脾臟切除附帶的正常胰腺組織。

二、免疫組化染色

取4%甲醛固定的組織標本，石蠟包埋，切片，常規行免疫組化染色。兔抗人BDNF單抗購自SantaClauz公司，工作濃度1∶200，生物素化標記的鼠抗兔二抗購自北京中杉金橋公司，工作濃度1∶200，最后加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，DAB反應染色。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。腫瘤細胞或間質內皮細胞胞質或胞膜出現棕黃色顆粒為陽性。由病理科醫師盲法讀片。每張切片先在低倍鏡下選取胰腺細胞密集區，再在高倍鏡下取10個視野計數1 000個細胞，計算染色細胞占總細胞數的百分數，以染色細胞≥20%為陽性，<20%為陰性。

三、RT-PCR法

取新鮮的組織標本，應用Trizol提取總RNA。BDNF上游引物為5′-TTAGCGAGTGGGTCACAGCG-3′，下游引物為5′-ATTGGGTAGTTCGGCATTGC-3′，擴增產物長度207 bp。以β-actin作為內參。引物由上海生工生物工程有限公司合成。先用逆轉錄試劑盒(杭州博日公司)轉錄成cDNA，按說明書操作，再行PCR擴增。PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s，27個循環，最后72℃延伸7 min。取5μl PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，UVI凝膠成像掃描儀掃描，以目的條帶與內參條帶灰度比值作為mRNA的相對表達量。

四、蛋白質印跡法

取新鮮胰腺組織切成小塊，加裂解液制備成勻漿，離心取上清進行蛋白定量。取50 μg蛋白常規行蛋白質印跡法檢測BDNF表達量。以β-actin作為內參。所用抗體同免疫組化法抗體。最后滴加ECL發光，X線曝光、顯影、定影。應用掃描儀掃描，以目的條帶與內參條帶的灰度比值表示蛋白相對表達量。

五、統計學處理

結 果

一、BDNF蛋白的表達

免疫組化染色顯示，正常胰腺組織僅見少許胰腺腺泡細胞的胞質及部分導管細胞胞核出現淺黃色顆粒。胰腺導管腺癌組織中BDNF蛋白主要表達在癌細胞胞質、神經鞘膜及神經周圍，且靠近神經組織的癌細胞BDNF陽性程度高于遠離神經組織癌細胞(圖1)，BDNF陽性表達率為52.2%(24/46)。胰腺良性疾病BDNF陽性表達率為7.8%(3/38)，其中慢性胰腺炎2例，胰腺囊腫1例。胰腺癌與胰腺良性病變的BDNF陽性表達率差異具有統計學意義(χ2=18.706，P<0.01)。

圖1 正常胰腺組織(a)、慢性胰腺炎組織(b)、無神經浸潤的胰腺癌組織(c)及有神經浸潤的胰腺癌組織(d)BDNF蛋白的表達(HE ×200)

蛋白質印跡法檢測結果顯示，正常胰腺、胰腺良性疾病、胰腺癌組織中BDNF蛋白的表達量分別為0.38±0.01、0.56±0.01、0.97±0.01(圖2)。胰腺癌和胰腺良性疾病組織的BDNF表達量顯著高于正常胰腺組織(t值分別為11.407、13.032，P值均<0.01)；胰腺癌的表達量又顯著高于胰腺良性疾病(t=6.896，P<0.01)。

二、BDNF mRNA表達

正常胰腺、胰腺良性疾病、胰腺癌組織中BDNF mRNA的表達量分別為0.85±0.14、1.67±0.21、3.45±0.67。胰腺癌和胰腺良性疾病組織的表達量顯著高于正常胰腺組織(t值分別為10.304、11.425,P值均<0.01)；胰腺癌的表達量又顯著高于胰腺良性疾病(t=7.525,P<0.01)。

三、BDNF表達與胰腺癌臨床病理參數間的相關性

BDNF表達與腫瘤神經浸潤及淋巴結轉移有相關性(P值均<0.05)，而與患者年齡、性別及腫瘤直徑、部位、分化程度均無相關性(P值均>0.05，表1)。

表1 胰腺癌組織BDNF表達與臨床病理參數間的關系

討 論

BDNF主要分布于大腦中樞神經系統、外周神經系統、內分泌系統、骨和軟骨等組織內。BDNF在腦內主要位于大腦皮質各層、海馬各區、腦干以及小腦的神經元胞體及部分神經突起。它主要定位于細胞的胞質。通過與配體酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，TrkB) 特異性高親和力結合，參與維持正常腦組織細胞的生理功能。也有研究證實[8]，BDNF可與TrkB或p75神經營養蛋白受體(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)結合，通過胞內信號轉導的瀑布效應阻斷或介導細胞的程序性凋亡，從而抑制或者促進凋亡的發生[8-9]。BDNF與TrkB結合后可激活Ras癌基因，使其下游效應因子磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)和Raf激酶啟動PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK激酶信號途徑而抑制細胞的失巢凋亡，誘導腫瘤細胞增殖和遷移[10-11]。Pearse等[12]的研究也證實，BDNF/TrkB信號轉導途徑可以促進腫瘤細胞的存活，有助于腫瘤的進展。

本研究結果顯示，胰腺癌組織BDNF mRNA及蛋白表達量顯著高于正常胰腺組織及胰腺良性疾病組織，與文獻報道的結果相符[13-15]，提示BDNF可能參與胰腺腫瘤的自分泌生長刺激和浸潤性生長。本結果還顯示，胰腺癌組織內的神經鞘膜及神經周圍亦有BDNF的表達，且靠近神經組織的癌細胞BDNF陽性程度高于遠離神經組織癌細胞，可見BDNF的表達與腫瘤的神經浸潤呈正相關，提示BDNF與胰腺癌神經浸潤密切相關。臨床病理分析結果表明,BDNF的表達與胰腺導管腺癌患者的年齡、性別及腫瘤大小、部位等因素均無顯著相關性，但與胰腺導管腺癌的神經浸潤及淋巴結轉移顯著相關，也提示BDNF表達水平可能與胰腺癌患者預后有關。

參 考 文 獻

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