富氫水抗1型糖尿病小鼠腎臟氧化應(yīng)激的作用

趙晨晨，王清清，邱朋程，朱鵬磊，蘇中錢(qián)，毛雨彥，宋張娟，金可可

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.第一臨床醫(yī)學(xué)院；2.環(huán)境與公共衛(wèi)生管理學(xué)院；3.病理生理學(xué)教研室）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，氧化應(yīng)激參與DN的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。研究表明，糖尿病發(fā)生時(shí)，高血糖可促使NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，Nox4）異常激活，產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）[1]。血紅素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）是體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，HO-1通過(guò)分解血紅素，產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)，保護(hù)機(jī)體。近年研究證明氫氣可選擇性中和自由基，如羥基（·OH）和過(guò)氧亞硝酸根（ONOO-），且氫氣分子量小，能夠以擴(kuò)散方式快速到達(dá)靶細(xì)胞，發(fā)揮抗氧化作用[2]。本研究旨在觀察富氫水對(duì)糖尿病腎臟組織Nox4和HO-1蛋白表達(dá)的影響，探討富氫水對(duì)糖尿病腎臟的可能保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只健康雄性ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物及試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；血糖儀及試紙購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司；富氫水購(gòu)自上海第二軍醫(yī)大學(xué)潛水醫(yī)學(xué)教研室；HO-1、Nox4多克隆抗體和DAB顯色試劑盒購(gòu)自河北博海生物工程開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 模型建立與分組 60只小鼠隨機(jī)分成3組：空白對(duì)照組（A組）、糖尿病組（B組）、糖尿病富氫水干預(yù)組（C組），每組20只。用0.1 mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液將STZ配制成1%的溶液。小鼠禁食12 h后，B組和C組按150 mg/kg劑量一次性腹腔注射STZ溶液誘發(fā)糖尿病，A組注射等體積緩沖液。給藥7 d后，禁食12 h，尾靜脈采血，測(cè)定小鼠空腹血糖＞11.0 mmol/L認(rèn)定造模成功。B組和C組各造模成功13只。小鼠糖尿病模型建立后，C組每天腹腔注射5 mL/kg的富氫水，B組每天腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，每2周測(cè)定小鼠體質(zhì)量及血糖。8周后，處死小鼠，游離腎臟，洗凈吸干。取部分腎臟組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋，制成5μ m厚度切片，其余腎臟組織凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)SP法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用DAB顯色。光鏡標(biāo)本每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算免疫組織化學(xué)評(píng)分（immunohistochemical scores，IHS）。IHS=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)×陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖 B組與C組的空腹血糖值均明顯高于A組（P＜0.01），B組與C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 3組小鼠空腹血糖值比較

2.2 腎臟組織HE染色觀察 肉眼觀察3組小鼠腎臟形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰。HE染色光鏡下見(jiàn)3組腎小球基底膜厚度均勻，無(wú)足突細(xì)胞融合；腎小管細(xì)胞無(wú)增生肥大，無(wú)腫脹；系膜細(xì)胞無(wú)腫脹，無(wú)基質(zhì)增生。見(jiàn)圖1。

2.3 腎臟Nox4和HO-1蛋白表達(dá) 3組小鼠腎臟Nox4和HO-1均有陽(yáng)性表達(dá)，與B組比較，C組Nox4表達(dá)明顯降低，但2組均高于A組（見(jiàn)圖2、表2），同時(shí)C組HO-1表達(dá)增多，且明顯高于A組和B組（見(jiàn)圖3、表2）。

圖1 3組小鼠腎臟組織HE染色結(jié)果（×200）

圖2 3組小鼠腎臟Nox4蛋白表達(dá)（SP，×400）

圖3 3組小鼠腎臟HO-1蛋白表達(dá)（SP，×400）

表2 3組小鼠腎臟Nox4和HO-1 IHS（±s）

表2 3組小鼠腎臟Nox4和HO-1 IHS（±s）

與A組比：aP＜0.01；與B組比：bP＜0.01

組別 n Nox4 HO-1 A組 20 1.05±0.22ab 3.85±0.37ab B組 13 3.92±0.28ab 3.08±0.28ab C組 13 2.15±0.38ab 7.54±0.88ab

3 討論

本研究結(jié)果顯示，糖尿病小鼠腎臟Nox4表達(dá)顯著升高，而HO-1降低，提示糖尿病動(dòng)物的腎臟氧化應(yīng)激水平升高。C組與B組比較，Nox4水平明顯下降，HO-1表達(dá)量增加，而2組小鼠空腹血糖值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明富氫水無(wú)明顯降血糖作用，但在高血糖狀態(tài)下可發(fā)揮抗氧化作用，明顯降低腎臟氧化應(yīng)激水平。

Nox4是NADPH氧化酶催化亞基gp91phox的同源物，主要在腎臟中表達(dá)，參與腎臟的正常功能調(diào)節(jié)。糖尿病發(fā)生時(shí)，持續(xù)的高血糖促使Nox4異常激活，Nox的活化依賴于蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）介導(dǎo)的磷酸化，Nox絡(luò)合物形成后促使ROS大量生成，過(guò)多的ROS激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC）使得細(xì)胞膜中的磷脂酰肌醇分解[3]，產(chǎn)生第二信使二酰基甘油（diacylglycerol，DAG），DAG又可以激活PKC，由此形成惡性循環(huán)，加重腎臟損傷。氫分子已在大量實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)具有抗氧化應(yīng)激作用，本實(shí)驗(yàn)中富氫水可通過(guò)減少Nox4表達(dá)，以減弱氧化應(yīng)激循環(huán)。Yu等[4]在原發(fā)性高血壓大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，以6 mL/（kg·d）的劑量連續(xù)應(yīng)用富氫水3個(gè)月后，左心室Nox2和Nox4表達(dá)明顯減少，氧化應(yīng)激水平降低，左室肥厚進(jìn)程減緩。

HO-1是體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，其生理作用在于催化血紅素分解成CO、鐵和膽綠素，這些物質(zhì)均具有抗氧化作用。Zhai等[5]給腦膜中動(dòng)脈閉塞的大鼠口服乳果糖，誘發(fā)內(nèi)源產(chǎn)氫，通過(guò)RT-PCR和蛋白印記法檢測(cè)NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nfr2）表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳果糖處理組Nrf2 mRNA及Nrf2蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，由此推斷氫氣可以激活Nrf2表達(dá)。Kawamura等[6]將Nrf2基因敲除小鼠暴露于高氧環(huán)境下60 h，結(jié)果氫治療的小鼠肺氧化應(yīng)激水平降低，但HO-1合成量不變，而Nrf2基因未敲除小鼠，接受氫治療后氧化應(yīng)激水平降低，HO-1及Nrf2 mRNA合成量增加。本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病小鼠腹腔注射富氫水8周后，HO-1表達(dá)增加，其機(jī)制可能與氫氣激活HO-1的調(diào)控因子Nfr2有關(guān)。氫氣激活Nrf2的過(guò)程涉及氧自由基及內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)[5]，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

Chihiro等[7]在缺血再灌注模型中驗(yàn)證富氫水對(duì)腎臟的保護(hù)作用，24 h的富氫水治療能明顯減輕腎水腫，改善間質(zhì)充血，減弱炎癥反應(yīng)。大鼠腎臟缺血再灌注損傷后，血肌酐、尿素氮等明顯增高，富氫水的處理能顯著降低這些指標(biāo)，改善腎功能[8]。但本研究中，B組及C組腎組織學(xué)切片均未發(fā)現(xiàn)明顯病變，可能因小鼠尚處于DN的早期，損害程度較輕微，無(wú)法從大體及光鏡下觀察到富氫水對(duì)糖尿病腎臟的保護(hù)作用。

在糖尿病方面，Kamimura等[9]證實(shí)飲用氫水后，小鼠血糖及甘油三酯含量均降低。Kajiyama等[10]對(duì)6例糖耐量受損患者進(jìn)行安慰劑對(duì)照試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)飲用氫水后，2/3的患者糖耐量恢復(fù)正常。但本實(shí)驗(yàn)中富氫水對(duì)小鼠血糖的影響不明顯，這可能與不同實(shí)驗(yàn)中所使用的氫劑量差異有關(guān)。同時(shí)，在糖尿病視網(wǎng)膜病模型中，大鼠飲氫水4周，caspase-3活性減弱，視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡減少，但該研究也未得出氫水對(duì)血糖有改善作用的結(jié)論[11]。所以富氫水對(duì)血糖的影響還有待進(jìn)一步明確。