同一胎鼠腸和腦神經(jīng)干細胞神經(jīng)遞質(zhì)的表達

夏立廣，李仲榮，劉森清，王永飚，朱利斌，趙一鳴

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 育英兒童醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325027）

神經(jīng)遞質(zhì)是發(fā)生突觸聯(lián)系的中介，經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)目前已經(jīng)明確的膽堿類主要為乙酰膽堿（acetylcholine，Ach），單胺類包括腎上腺素、去甲腎上腺素（noradrenaline，NA）、多巴胺、5-羥色胺，氨基酸類包括谷氨酸、門冬氨酸、γ-氨基丁酸（gammaaminobutyric acid，GABA）、甘氨酸等，以及其他的神經(jīng)遞質(zhì)包括一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化碳、前列腺素、P物質(zhì)、組氨和神經(jīng)肽等。幾乎所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的遞質(zhì)均存在于腸神經(jīng)系統(tǒng)中。本實驗研究有代表性的Ach、NO、NA、GABA這4種遞質(zhì)在腸神經(jīng)干細胞和腦神經(jīng)干細胞間的差異，為今后如何獲得合適的、有功能的、能長期使用的移植干細胞提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM/F12、N2-supplement、B27-supplement、青霉素/鏈霉素、0.25%胰酶-EDTA為Gibco公司產(chǎn)品；bFGF、EGF、粗膠原酶、維甲酸、錐蟲藍為Sigma公司產(chǎn)品；二巰基乙醇、HFN為Chemicon公司產(chǎn)品；兔抗GABA、神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neurona nitric oxide synthase，nNOS）、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransterase，ChAT）、多巴胺β羥化酶（dopamine β-hydroxylase，DβH）、兔IgG同型對照抗體為abcam公司產(chǎn)品；DyLight488熒光二抗為KPL公司產(chǎn)品；酶標山羊抗兔二抗為PTG公司產(chǎn)品；固定通透試劑盒為BD公司產(chǎn)品；DAB顯示試劑盒為武漢博士德產(chǎn)品；低熔點瓊脂糖為上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品；流式細胞儀為BD公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱為Thermo公司產(chǎn)品。實驗動物為孕20 d的SD大鼠（清潔級），由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 培養(yǎng)液及2種神經(jīng)干細胞原代、傳代培養(yǎng)及鑒定方法 從孕20 d的同一SD胚鼠中分別提取腸神經(jīng)干細胞和腦神經(jīng)干細胞，采用改良的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液反復傳代，取傳代培養(yǎng)6～10 d后得到的2種不同來源的神經(jīng)細胞球。參見文獻[1-2]。

1.3 神經(jīng)遞質(zhì)標志物 Ach、NO、NA、GABA這4種遞質(zhì)相對應的標志物分別為ChAT、nNOS、DβH、GABA抗體。

1.4 瓊脂糖預包埋免疫細胞化學檢測 本實驗選用的一抗分別為：1∶15 000抗GABA，1∶100抗nNOS，1∶1 000抗ChAT，1∶2 000抗DβH。將傳代培養(yǎng)得到2種不同來源的神經(jīng)細胞球進行瓊脂糖預包埋，分別制成石蠟切片。常規(guī)處理經(jīng)GABA、nNOS、ChAT、DβH免疫細胞化學染色，DAB顯色后蘇木素復染。具體步驟參見文獻[2]。

1.5 流式細胞儀檢測 本實驗選用的一抗分別為：1∶300抗GABA，1∶30抗nNOS，1∶100抗ChAT，1∶200抗DβH。分別設有同型對照組，流式細胞儀測定2種不同來源神經(jīng)干細胞GABA、nNOS、ChAT、DβH熒光染色陽性細胞數(shù)目，每次每組測3管細胞，重復3次，計算陽性細胞合計率。具體步驟參見文獻[2]。

1.6 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件。免疫細胞化學檢測數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析，流式細胞儀檢測數(shù)據(jù)采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖預包埋免疫細胞化學檢測結(jié)果 分別設有空白對照組（見圖1）、GABA、nNOS、ChAT、DβH組（見圖2-5），其陽性細胞的胞漿為黃色。

保持顯微鏡下相同條件下，全部用手動設置等條件下，拍攝400倍照片，每張切片隨機拍攝3個視野，重復3次，每組共9張，并使用IPP6.0軟件分析，把圖像中呈現(xiàn)黃色的區(qū)域作為AOI（area of interest）進行分析。選擇測量參數(shù)為累積面積、平均光密度和累積光密度（integrated optical density，IOD）。2種不同神經(jīng)干細胞GABA、nNOS、ChAT、DβH組與相應的空白對照組相比：腸神經(jīng)干細胞nNOS組、ChAT組累積面積、平均光密度和IOD與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腦神經(jīng)干細胞nNOS組、ChAT組、DβH組累積面積、平均光密度和IOD與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

圖1 空白對照組神經(jīng)球瓊脂糖預包埋石蠟切片免疫細胞化學染色（×400）

圖2 GABA組神經(jīng)球瓊脂糖預包埋石蠟切片免疫細胞化學染色（×400）

圖3 nNOS組神經(jīng)球瓊脂糖預包埋石蠟切片免疫細胞化學染色（×400）

圖4 ChAT組神經(jīng)球瓊脂糖預包埋石蠟切片免疫細胞化學染色（×400）

圖5 DβH組神經(jīng)球瓊脂糖預包埋石蠟切片免疫細胞化學染色（×400）

2.2 流式細胞儀檢測結(jié)果 流式細胞儀檢測提示：腸神經(jīng)干細胞GABA、nNOS、ChAT、DβH陽性細胞合計率分別為1.59%、14.97%、5.43%、1.36%，其中nNOS、ChAT與相應的同型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而腦神經(jīng)干細胞GABA、nNOS、ChAT、DβH陽性細胞合計率分別為1.68%、6.14%、25.42%、9.30%，其中nNOS、ChAT、DβH與相應的同型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

綜合上述結(jié)果提示，腸神經(jīng)干細胞表達的神經(jīng)遞質(zhì)為NO和Ach，且以NO為主；腦神經(jīng)干細胞表達的神經(jīng)遞質(zhì)為NO、Ach和NA，且以Ach為主。GABA在2種神經(jīng)干細胞中均無明顯表達；NA在腦神經(jīng)干細胞中有表達，而在腸神經(jīng)干細胞中不表達。

通過比較均表達NO和Ach的2種不同來源神經(jīng)干細胞nNOS組和ChAT組相關參數(shù)顯示，腸神經(jīng)干細胞表達的NO總量以及每個nNOS陽性細胞的NO的含量均較腦神經(jīng)干細胞高；而腦神經(jīng)干細胞表達的Ach總量較腸神經(jīng)干細胞高，但每個ChAT陽性細胞的Ach含量卻是腸神經(jīng)干細胞高。

3 討論

神經(jīng)遞質(zhì)通過突觸聯(lián)系傳遞各種信息而實現(xiàn)調(diào)節(jié)機體生理功能的作用，幾乎所有的神經(jīng)遞質(zhì)均存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中。

GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，發(fā)育腦及原代培養(yǎng)的腦細胞研究證明，在突觸形成之前GABA作用具有多樣性，但在神經(jīng)發(fā)育早期，GABA的確切作用仍不清楚。Pontes等[3]研究表明，GABA通過離子移變A受體和代謝性B受體，對神經(jīng)干細胞、神經(jīng)前體細胞、成神經(jīng)細胞進行正性刺激。在消化系統(tǒng)中GABA除了作為神經(jīng)遞質(zhì)外，還是一種胃腸激素。Weigert等[4]研究證實GABA參與迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)的胃泌素和生長抑素的釋放。在幽門結(jié)扎的大鼠中，GABA和巴氯芬通過增加胃黏液分泌，抑制胃蛋白酶分泌，降低胃黏膜細胞脫落，發(fā)揮胃黏膜保護作用[5]。有報道[6]稱GABA可通過GABA（B）受體的介導抑制腸段的收縮。我們的數(shù)據(jù)顯示GABA在腸神經(jīng)干細胞及腦神經(jīng)干細胞中均無明顯表達，考慮原因可能是我們所采用的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液不適合神經(jīng)干細胞的GABA能神經(jīng)元表達，GABA能神經(jīng)元是產(chǎn)生和釋放GABA的主要來源。有報道[7]稱Mash1與Hes1共表達時，能夠促進GABA能神經(jīng)元形成，而骨形成蛋白-2[8]可促進室管膜下區(qū)的神經(jīng)干細胞向GABA能神經(jīng)元的分化，增加這些因素的表達及含量可能也有利于我們所培養(yǎng)的這2種神經(jīng)干細胞的GABA能神經(jīng)元表達。

表1 神經(jīng)干細胞4種神經(jīng)遞質(zhì)免疫細胞化學檢測結(jié)果（±s）

表1 神經(jīng)干細胞4種神經(jīng)遞質(zhì)免疫細胞化學檢測結(jié)果（±s）

與空白對照組相同指標比：aP＜0.05

組別 累計面積 平均光密度 IOD腸神經(jīng)干細胞 腦神經(jīng)干細胞 腸神經(jīng)干細胞 腦神經(jīng)干細胞 腸神經(jīng)干細胞 腦神經(jīng)干細胞空白對照組 1 261±24 1 245±40 0.095±0.005 0.096±0.004 122±7 124±6 GABA組 1 299±43 1 260±58 0.096±0.003 0.100±0.007 127±6 128±10 nNOS組 34 641±1 195a 17 845±601a 0.185±0.004a 0.132±0.004a 5 954±195a 2 556±103a ChAT組 24 895±874a 64 921±2 912a 0.153±0.005a 0.139±0.004a 4 011±187a 11 718±485a DβH組 1291±65 43 788±1 517a 0.100±0.009 0.145±0.007a 129±14 7 208±419a

表2 神經(jīng)干細胞4種神經(jīng)遞質(zhì)流式細胞儀檢測結(jié)果

NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著至關重要的作用。在正常腦組織內(nèi)，NO對于神經(jīng)前體細胞的增殖具有負相的調(diào)節(jié)作用，但在腦損傷后，在不同的神經(jīng)和非神經(jīng)細胞中過剩的NO促進了神經(jīng)發(fā)生[9]。薩喆燕等[10]研究發(fā)現(xiàn)，NO促進大鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞分化。有研究表明NO是一種受神經(jīng)營養(yǎng)因子影響的旁分泌信使，通過對新產(chǎn)生的神經(jīng)元進行調(diào)節(jié)來控制神經(jīng)前體細胞的增殖和分化[11]。也有研究表明NO的調(diào)節(jié)是雙向的，神經(jīng)干細胞nNOS表達既促進其增殖也是其分化所必需的；而神經(jīng)元的nNOS表達抑制神經(jīng)干細胞增殖，阻礙其分化[12]。NO在消化道系統(tǒng)[13]中的作用不言而喻，腸神經(jīng)元直接控制腸壁肌肉活動，它主要通過興奮性的膽堿能神經(jīng)和抑制性的氮能神經(jīng)發(fā)揮作用。NO可以松弛離體人類正常結(jié)腸及無神經(jīng)節(jié)細胞腸段巨結(jié)腸肌條，是正常結(jié)腸及無神經(jīng)節(jié)細胞癥結(jié)腸松弛反應的遞質(zhì)。氮能神經(jīng)元功能異常或缺陷是腸神經(jīng)肌肉疾病的一個重要病因[14-16]，可導致先天性巨結(jié)腸、賁門失弛緩和幽門肥厚性狹窄等疾病。這些研究結(jié)果給由NO引起的臨床上一些神經(jīng)系統(tǒng)性疾病治療帶來可喜的理論前景。本實驗結(jié)果顯示NO在2種神經(jīng)干細胞中均有表達，但腸神經(jīng)干細胞NO的表達量及每個nNOS陽性細胞NO的含量較腦神經(jīng)干細胞高，這提示在相同的條件下腸神經(jīng)干細胞可能比腦神經(jīng)干細胞更適合作為誘導氮能神經(jīng)元的種子細胞，治療上述疾病。

在大腦內(nèi)，末梢釋放Ach的膽堿能神經(jīng)元廣泛分布在腦干及前腦，主要參與機體心血管活動、攝食、覺醒、感覺、運動等的調(diào)節(jié)。Winkler等[17]將基因修飾的膽堿能細胞移植于大鼠基底神經(jīng)核后可以改善空間定向能力。另外，膽堿能細胞對記憶功能也有改善作用[18]。有研究表明Ach促進了神經(jīng)干細胞及其子代細胞的增殖和分化，拮抗劑阿托品則阻斷這種增強作用，并抑制神經(jīng)干細胞的分化[19]。膽堿能神經(jīng)元是腸道種類最多的一種神經(jīng)元，包括感覺、運動、分泌及中間神經(jīng)元。Ach是腸道副交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)及盆神經(jīng)主要的神經(jīng)遞質(zhì)，膽堿能神經(jīng)元對腸道動力主要起興奮的作用。本組數(shù)據(jù)顯示Ach在2種神經(jīng)干細胞中均有表達，腦神經(jīng)干細胞Ach的表達總量較腸神經(jīng)干細胞高，但每個ChAT陽性細胞的含量卻比腸神經(jīng)干細胞低。這提示在相同的條件下腦神經(jīng)干細胞比腸神經(jīng)干細胞含有更多膽堿能神經(jīng)元，但兩者間不可以認為只有量的不同。這可能與腸神經(jīng)干細胞含量較少，有較多其他組織細胞混雜有關，如果將腸神經(jīng)干細胞進一步純化的話，膽堿能神經(jīng)元的含量可能會得到提高，也同樣適合作為誘導膽堿能神經(jīng)元的種子細胞，治療相關的疾病。有報道[20]稱Lhx8高表達促進海馬神經(jīng)干細胞往膽堿能神經(jīng)元分化，是否試用其他神經(jīng)干細胞有待進一步研究。

中樞去甲腎上腺素能神經(jīng)元胞體在藍斑聚集，發(fā)出神經(jīng)纖維投射到腦的各個部位，在腦內(nèi)形成了彌散連接，構(gòu)成了中樞NA發(fā)揮作用的神經(jīng)解剖學基礎，參與心血管活動、體溫、情緒活動的調(diào)節(jié)，也與維持大腦皮質(zhì)的覺醒狀態(tài)有關。有研究[21]報道基因敲除小鼠絕大部分難以存活，其主要原因是藍斑不能合成NA來完成機體多種功能的調(diào)節(jié)。在消化系統(tǒng)，交感神經(jīng)末梢釋放NA，通過其受體Naα對胃腸運動起抑制作用。有學者認為，功能性胃排空障礙是胃腸交感神經(jīng)活動增強，胃壁釋放NA或其他抑制性物質(zhì)直接與胃腸平滑肌細胞膜上的受體結(jié)合，阻止胃腸平滑肌中的副交感神經(jīng)釋放Ach，從而抑制胃的肌電活動，延緩胃的排空，這是目前被認為產(chǎn)生這種疾病的主要發(fā)病機制[22]。本實驗數(shù)據(jù)顯示NA只在腦神經(jīng)干細胞中表達，在腸神經(jīng)干細胞中未見表達，免疫細胞化學檢測結(jié)果及流式數(shù)據(jù)顯示兩者在NA方面差異較大。這可能與這2種神經(jīng)干細胞的來源本身屬性有關，腦神經(jīng)干細胞可能更適合作為誘導去甲腎上腺素能神經(jīng)元的種子細胞，治療相關的疾病。此外，Mong等[23]報道通過對胚胎干細胞在適當?shù)男盘枟l件下導入Phox2b，去甲腎上腺素能神經(jīng)元可以高效率誘導，為獲得更多特定的去甲腎上腺素能神經(jīng)元種子細胞提供可能。