人支氣管上皮細胞中苯并芘誘導TNF-α表達的分子機制

代佳，呂建祎，張敏，蔡秦真，高基民

（浙江省模式生物技術與應用重點實驗室，溫州醫科大學 檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州325035）

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是TNF超家族中的一員，主要是由單核巨噬細胞、淋巴細胞產生的細胞因子。同時，多種腫瘤細胞（肺癌細胞、B淋巴細胞瘤、乳腺癌和結腸癌等）[1]也均可檢測到其表達。TNF-α是炎癥反應中出現最早、最重要的炎性遞質之一，與其受體TNFR（TNF-R1、TNF-R2）結合后，通過激活NF-κB、JNK和MAPK信號通路[2]，可調節細胞炎性和其他細胞反應。而且越來越多的研究顯示，TNF-α可以通過促進細胞增殖，血管生成和調節新陳代謝，促進腫瘤的發生與發展[3-5]。在全球，肺癌的發病率和病死率均居癌癥之首。研究[6]顯示90%的肺癌與吸煙相關。香煙中含有的苯并芘（B[a]P）及其代謝產物B[a]PDE是煙草中最重要、最強有力的肺致癌物質[7]。B[a]P及B[a]PDE在慢性肺炎及肺部腫瘤的形成過程中發揮重要作用，而肺部炎癥的持續存在與肺癌的形成之間存在著緊密聯系[8-9]。

我們在人支氣管上皮細胞（Beas-2B）中研究了B[a]P對炎癥因子TNF-α mRNA表達的調控機制。已有研究表明，TNF-α基因調節序列中包含轉錄因子NF-κ B和AP1的結合序列[10-11]，說明了TNF-α轉錄調節的復雜性。實驗中將不同長度片段的TNF-α基因啟動子序列成功克隆入psiCHECK-2載體熒光素酶報告基因上游。并且發現24 h內，B[a]P能夠通過促進TNF-α mRNA的轉錄從而促進TNF-α mRNA的表達，為以后更深一步地研究TNF-α在B[a]P誘導肺慢性炎癥至肺癌的發生發展中的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞 Beas-2B細胞由紐約大學黃傳書教授惠贈。

1.2 材料 B[a]P（Sigma）；DMEM培養基和FBS（GIBCO公司）；psiCHECK-2載體（上海吉瑪公司）；DH5α菌株（實驗室保存）；Trizol（Invitrogen公司）；反轉錄試劑盒（大連寶生物工程公司）；Power SYBR? Green PCR Master Mix（Applied Biosystems公司）；Dual-luciferase reporter Kit（Promega公司）；Lipofectamine? 2000 Reagent（Invitrogen公司）；T4 DNA連接酶、細胞基因組DNA提取試劑盒、PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase、DL 2 000 DNA Marker、DL 10 000 DNA Marker、限制性內切酶XholI、NotI均購自大連寶生物工程公司；Plasmid Miniprep Kit（天根生化科技有限公司）；Gel Extration Kit（上海捷瑞生物工程有限公司）；其余試劑均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 Beas-2B細胞中TNF-α mRNA表達量的檢測：將Beas-2B細胞種于6孔板中，8 μ mol/L B[a]P處理不同的時間后，收集細胞，加入Trizol提取細胞總的RNA，將提取好的RNA在NANO DROP 2000儀器上測定其RNA濃度，且A260/A280為1.9～2.1。按照反轉錄試劑盒的使用說明進行反轉錄反應，Real time-PCR檢測其中TNF-α mRNA水平隨B[a]P處理時間不同表達量的變化。Real Time-PCR所用引物見表1。

1.3.2 引物設計及其合成：自UCSC Genome Browser網站數據庫檢索獲得TNF-α啟動子序列（見圖1），分別設計2段啟動子引物序列（見表2）。結合載體單克隆位點上的限制性內切酶位點和這2段啟動子序列的堿基情況，在上游引物5'端加入XholI的酶切位點CTCGAG，在下游引物5'端加入NotI的酶切位點GCGGCCGC。從轉錄起始零點開始，2段啟動子片段長度分別為：-2 000～+186（2 186 bp）和-1 000～+186（1 186 bp）。

表1 Real Time-PCR所用引物

圖1 人TNF-α基因啟動子DNA序列

表2 構建人TNF-α基因啟動子區報告基因質粒所用引物

1.3.3 TNF-α啟動子基因的克隆：以Beas-2B細胞中提取的基因組DNA為模板，以UCSC網站獲得的TNF-α啟動子序列設計的引物，采用高保真酶Prime-STAR? GXL DNA Polymerase進行PCR擴增。PCR反應體系為20 μL：PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.4 μL，5×PrimeSTAR GXL Buffer（Mg2+Plus）4 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，模板1 μL，分別取上游引物F1、F2和下游引物R各0.5 μL，加ddH2O至總體積20 μL。反應條件：98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，56 ℃ 2 min，30個循環。反應結束后，取2 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段擴增結果，剩余的PCR產物進行膠回收，得到2段不同長度（2 186 bp和1 186 bp）的TNF-α基因啟動子片段。

1.3.4 TNF-α啟動子載體的構建與測序：采用XhoI、NotI這2種限制性內切酶對目的DNA片段和熒光素酶報告基因psiCHECK-2載體進行37 ℃雙酶切5 h，酶切產物全部進行1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的片段。回收的酶切產物用Nano Drop 2000測定其DNA濃度，按照目的基因與載體摩爾比1∶1的比例，在T4連接酶的作用下，于16 ℃連接12 h。連接產物以低溫CaCl2法轉化E.coli DH5α感受態細胞，涂于含50 mg/L氨芐青霉素的固體LB培養皿上，37 ℃培養12 h后挑取單克隆菌落，搖菌后用質粒小提試劑盒提取質粒，提取的質粒用Xhol、NotI進行雙酶切鑒定。同時，將提取的質粒送華大基因公司進行測序。

1.3.5 TNF-α啟動子載體轉染Beas-2B細胞：將構建成功的2種重組質粒psiCHECK-2-TNF-α-promoter1、psiCHECK-2-TNF-α-promoter2和空載體psiCHECK-2質粒做轉化提取質粒，Nano Drop 2000測定質粒濃度。將Beas-2B細胞種于24孔板，按照Lipofectamine?2000脂質體轉染試劑說明，當細胞密度達到80%時進行轉染實驗。每孔分別定量加入psiCHECK-2-TNF-αpromoter1、psicheck2-TNF-α-promoter2質粒和空載體psiCHECK-2質粒0.8 μg、Lipofectamine? 2000 2 μL和無血清培養基100 μL。6 h后換含10% FBS、1%雙抗的DMEM培養基，37 ℃、5% CO2培養箱培養。

1.3.6 報告基因活性的檢測：瞬時轉染48 h后收集細胞，每個樣本分3個復孔，每孔加75 μL的細胞懸液，再加入75 μL的Dual-Glo? Luciferase Reagent，混勻。25 ℃孵育10 min，待細胞充分裂解后，酶標儀測量螢火蟲熒光值（Firefly Luc）。再向每孔中加入75 μL的Dual-Glo? Stop&Glo? Reagent，混勻。25 ℃孵育10 min，酶標儀測量海腎熒光值（Renilla Luc）。計算Firefly Luc/Renilla Luc的比值，并以空載體psiCHECK-2轉染細胞作對照，以判斷promoter1[psiCHECK-2-TNF-α-promoter1（2 186 bp）]和promoter2[psiCHECK-2-TNF-α-promoter2（1 186 bp）]2種啟動子的活性。

1.3.7 在B[a]P處理下TNF-α啟動子活性的檢測：Beas-2B細胞和293T細胞瞬時轉染psiCHECK-2-TNF-α-promoter1、psiCHECK-2-TNF-α-promoter2重組質粒和空載體psiCHECK-2后，用含1% FBS、1%雙抗的DMEM培養基饑餓細胞12 h，加B[a]P刺激細胞不同時間長度（0、12和24 h）。收集細胞檢測其熒光數值，計算Firefly Luc/Renilla Luc的比值，統計B[a]P刺激下其啟動子活性的變化。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS13.0統計軟件進行分析。組內差異采用單因素方差分析，組間差異分析采用雙因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 B[a]P對TNF-α mRNA表達的影響 24 h內，8 μmol/LB[a]P暴露下，Real time-PCR檢測Beas-2B細胞中的TNF-α mRNA的表達量呈升高趨勢（見圖2）。

圖2 8 μmol/L B[a]P暴露對TNF-α mRNA表達量的影響

2.2 TNF-α啟動子序列克隆 以Beas-2B細胞中提取的基因組DNA為模板，設計TNF-α不同位點的引物序列，進行PCR擴增，得到2段不同長度的TNF-α啟動子片段2 186 bp和1 186 bp（見圖3）。

圖3 TNF-α啟動子序列PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 TNF-α啟動子雙熒光素酶載體雙酶切鑒定及測序 將目的DNA片段和空載體psiCHECK-2（見圖4）進行XhoI、NotI雙酶切后，膠回收得到相應的條帶，在T4連接酶連接后轉化E.coli DH5α感受態細胞。提取的質粒再經XhoI、NotI雙酶切鑒定，2個重組質粒分別釋放出2 186 bp和1 186 bp大小的DNA片段（見圖5）。華大基因測序比對測序結果證實2個質粒包含2段相應長短的TNF-α啟動子序列，測序鑒定正確。

圖4 psiCHECK-2載體圖譜

TNF-α啟動子重組質粒：promoter1[psiCHECK-2-TNF-α-promoter1（2 186 bp）]和promoter2[psiCHECK-2-TNF-α-promoter2（1 186 bp）]重組質粒構建成功。

圖5 重組質粒雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 TNF-α啟動子活性的檢測 將2個重組熒光素酶報告質粒分別轉染到Beas-2B細胞中，檢測發現與對照質粒相比，2個重組質粒的熒光素酶活性均相對較高，表明2段啟動子序列均具有轉錄活性。而且，promoter1具有較高的啟動子活性。說明，2段序列均包含有TNF-α的啟動子部分（見圖6）。

圖6 TNF-α啟動子活性檢測

2.5 B[a]P對TNF-α啟動子活性的影響 熒光素活性檢測結果顯示，B[a]P暴露下，24 h內，Beas-2B細胞中重組質粒的熒光素活性呈升高趨勢（見圖7）。同時，在293T細胞中，B[a]P刺激也可以使重組質粒的熒光素活性升高（見圖8）。由此可以得知，B[a]P能夠促進TNF-α mRNA的轉錄，promoter2活性比promoter1強，且沒有細胞特異型。

圖7 8 μ mol/L B[a]P暴露對Beas-2B細胞中TNF-α啟動子活性的影響

圖8 8 μmol/L B[a]P暴露對293T細胞中TNF-α啟動子活性的影響

3 討論

150年前，Virchow最初發現慢性炎癥和腫瘤之間存在著關聯[12]。大量研究證實，慢性炎癥是腫瘤發生的一個重要的原因。炎癥微環境促進細胞轉化，例如HBV病毒引起肝炎、肝硬化，最終發展為肝癌[13]；幽門螺旋桿菌引起胃炎、胃潰瘍，最終發展為胃癌[14]；HPV病毒引起宮頸炎、宮頸糜爛，最終發展為宮頸癌等[15]。

在腫瘤微環境中，TNF-α的持續產生是多種惡性腫瘤發生的標志。同時，也可以作為腫瘤的預后指標[1]。如果組織中TNF-α表達水平較高，則表示預后不良。由于TNF-α可通過與其受體TNFR結合發揮作用，且TNF-α受體能在上皮細胞和基質細胞中表達。因此，TNF-α可以通過調節腫瘤細胞的增殖及存活直接促進腫瘤的發生發展。同時，TNF-α也可以通過影響腫瘤微環境中的上皮細胞和其他炎癥細胞，間接促進腫瘤的發生發展。另外，腫瘤基質細胞（包括巨噬細胞、樹突狀細胞和成纖維細胞）可以分泌多種炎癥因子（如TNF-α、IL-1和IL-6），這些細胞因子攻擊和招募更多的炎性細胞到達腫瘤微環境，增強其增殖及存活能力。

已有的研究表明，TNF-α參與腫瘤發生發展的各個進程[16]。首先，TNF-α可以誘導腫瘤的發生發展。一方面，TNF-α或TNF-α受體缺陷的小鼠對化學藥物誘導的皮膚癌的敏感性降低，而且很少發生轉移。在TNF-α基因缺陷的小鼠中，岡田酸和佛波酯也很難誘導皮膚癌的的發生。從以上可以看出，TNF-α的缺陷減緩了腫瘤的發生發展[17]。另一方面，TNF-α可以通過激活NF-κB、PKCα和AP-1信號通路，從而誘導腫瘤的發生發展。在小鼠上皮JB6細胞中，TNF-α可以使NF-κB活性增強（以劑量依賴的方式），這在細胞惡變的過程中起著非常重要的作用[18]。其次，TNF-α可以增強腫瘤細胞的增殖能力。TNF-α作為一個誘變劑，可以增強腫瘤細胞的增殖及存活。TNF-α可以通過激活NF-κB，從而促進細胞的存活及增殖，也可以通過編碼NF-κB依賴的抗凋亡分子的生成，從而促進腫瘤細胞的存活[19]。另外，TNF-α不僅是一個自分泌生長因子，也可以誘導其他生長因子的表達（如EGFR和TNF-α），從而促進腫瘤細胞的增殖。第三，TNF-α能夠促進腫瘤血管的生成。它可以通過調節多種血管生成因子，如IL-8、VEGF的表達，從而介導血管的形成。TNF-α也可以通過調控JNK和AP-1通路調節VEGF的表達[20]。另外，使用TNF-α的多克隆抗體可以完全中和TNF-α促進血管生成的作用[21]。最后，TNF-α可以促進腫瘤細胞的侵襲和轉化。在巨噬細胞中，TNF-α通過上調遷移抑制因子（MIF）誘NF-κ B和JNK信號通路的激活，促進腫瘤的侵襲[22]。在腫瘤細胞中，TNF-α通過誘導MMPs和MMPsα/2β1整合蛋白的產生，從而增強腫瘤細胞的侵襲能力。在纖維肉瘤組織中，TNF-α可以促進腫瘤的肺轉移[23]。在一些腫瘤細胞中，TNF-α可以通過NF-κB依賴的方式誘導趨化因子受體CXCR4、化學誘變蛋白MCP-1、IL-8和細胞內黏附分子-1的產生，從而增強細胞的遷移和轉化[24-25]。因此，TNF-α可以通過其對腫瘤細胞、基質細胞以及腫瘤微環境中的炎癥細胞的影響，從而促進腫瘤轉移。

大量研究報道，在非小細胞肺癌中，TNF-α在鱗癌和腺癌中的陽性表達率均較高[26-27]，說明在非小細胞肺癌的發生發展過程中，TNF-α作為一種重要的細胞因子參與，并發揮著重要作用。由于炎癥環境能夠促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，因此炎癥的持續存在與癌癥的形成之間存在密切聯系。慢性間質浸潤性肺部疾病包括各種各樣的疾病，通常從肺泡炎和/或細支氣管炎開始[28]。在粉塵誘發肺癌動物模型中，在晶體硅刺激下首先導致炎性肉芽腫的形成，之后 II型肺細胞和細支氣管上皮細胞開始增生，后期腺瘤出現并最終導致腺癌或鱗狀細胞癌，證實炎癥與肺部腫瘤的發生有直接聯系[29]。研究證實，在A/J小鼠模型中，反復的B[a]P刺激可能導致肺部慢性炎癥，從而增加腫瘤的發生率[30]。

有研究報道，在Beas-2B細胞中，環境中的有毒物質鎳可以通過調控TNF-α的啟動子活性從而誘導其表達，增加了肺癌發生的風險性[31]。同時，還有研究顯示，在小鼠表皮Cl41細胞中，香煙中B[a]P的代謝產物B[a]PDE可以誘導TNF-α的表達，參與了小鼠皮膚癌的發生，并在其癌癥的進展過程中也起著非常重要的作用[32]。

NF-κB是TNF-α信號通路中重要的信號分子，并在多種疾病的發生發展過程中起著重要作用，如：癌癥、哮喘、肌營養不良等。TNF可以通過IKK激酶復合體使IκBα蛋白的Ser32和Ser36或IκBβ蛋白的Ser19和Ser23 2個位點磷酸化，磷酸化的IκBα和IκBβ中的Lys21、Lys22泛素化，然后被S26蛋白酶復合體識別并迅速降解，使得NF-κ B的NLS暴露，進入核內起始轉錄，誘導多種凋亡抑制因子的表達[33]。因此可以得出，TNF在調控NF-κ B信號通路過程中起著重要的作用，進而影響了細胞的生存、增殖、分化以及死亡等細胞的多種生理病理性過程。

此項研究中，我們發現在B[a]P暴露下，24 h內，Beas-2B細胞中TNF-α的mRNA表達量呈升高趨勢，并對其調節機制進行了初步探索。以Beas-2B細胞基因組為模板，構建了包含不同長度片段的TNF-α啟動子序列的雙熒光素報告基因質粒，成功檢測到Beas-2B細胞中啟動子的表達。而且，用8 μmol/L B[a]P處理轉染了2個重組熒光素報告基因質粒的Beas-2B細胞后，24 h內，2個重組質粒的熒光素活性呈升高趨勢。為了證明B[a]P刺激細胞引起的這種變化有沒有細胞特異性，我們將重組質粒又轉染了293T細胞，結果發現，B[a]P作用于293T細胞后，2個重組質粒的熒光素活性也會升高，說明沒有細胞特異性。由此可以得知，B[a]P能夠促進TNF-α mRNA的轉錄從而促進TNF-α mRNA的表達，且promoter1要比promoter2活性強。這為以后更深一步地研究肺癌組織中TNF-α與各個炎癥因子之間的相互關系及其調控機制提供了有力的研究工具。