促紅細胞生成素對大鼠肢體缺血再灌注后腎血流的影響

劉彩樹 李為朋 閆合燕 張亞萍 蔡森 門秀麗 孔小燕 李宏杰

促紅細胞生成素對大鼠肢體缺血再灌注后腎血流的影響

劉彩樹 李為朋 閆合燕 張亞萍 蔡森 門秀麗 孔小燕 李宏杰△

目的探討促紅細胞生成素（EPO）對大鼠肢體缺血再灌注（LIR）后腎血流的影響及可能作用機制。方法30只雄性SD大鼠隨機分為Control組、LIR組和EPO+LIR組，每組10只；檢測各組動物腎血流量、血漿肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）含量、腎組織濕干比（W/D）、NO、一氧化氮能合成酶（NOS）及內皮素-1（ET-1）含量，采用免疫組織化學法檢測腎組織細胞間黏附分子（ICAM-1）和血管細胞黏附分子（VCAM-1）的表達，光鏡下觀察腎組織形態學改變。結果LIR組較Control組腎血流量減少，血漿Cr、BUN、腎組織W/D、NO、ET-1、NOS活性、ICAM-1和VCAM-1的表達增高(P＜0.05)，鏡下可見腎組織間隙增寬和炎細胞浸潤等病理改變。EPO+LIR組較LIR組腎血流量增加，血漿Cr、BUN、腎組織W/D、NO、ET-1和NOS活性、ICAM-1和VCAM-1的表達均降低(P＜0.05)，腎組織病理學變化有所減輕。結論EPO可改善LIR后大鼠的腎功能，增加腎血流量，其機制可能與減輕腎水腫、調節腎血管舒縮功能、減輕炎癥反應有關。

再灌注損傷;四肢;腎血漿流量,有效;紅細胞生成素；大鼠,Sprague-Dawley；疾病模型,動物

肢體缺血再灌注損傷（limb ischemia reperfusion,LIR）可對缺血肢體及遠隔器官造成損傷，腎臟是最易受累的器官之一[1]。研究表明，促紅細胞生成素（EPO）可減輕腎移植后的缺血再灌注損傷[2]。本研究旨在觀察LIR后大鼠腎血流的變化，探討EPO預處理對大鼠LIR后腎血流的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級雄性SD大鼠30只，體質量（250±20）g，購自北京華普康生物科技股份有限公司（SCXK京2009-0004）。人重組促紅細胞生成素（rhEPO）由沈陽三生制藥有限責任公司生產，NO、一氧化氮合成酶（NOS）及內皮素-1 （ET-1）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。細胞間黏附分子（ICAM-1）、血管細胞黏附分子（VCAM-1）單克隆抗體、PV6001/6002二步法免疫組化檢測試劑盒及濃縮二氨基聯苯胺（DAB）試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 動物分組及給藥30只SD大鼠采用隨機數字表法分為3組，每組10只。（1）LIR組。參考文獻[3]方法制作大鼠LIR模型，乙醚麻醉下將大鼠的雙后肢根部用橡皮帶環繞結扎，阻斷血流4 h，恢復血流灌注4 h后處死，從腹主動脈取血，3 000 r/min離心20 min，取血漿，Eppendorf管分裝，-70℃保存。取一部分左側腎臟，冷生理鹽水（NS）沖洗干凈，濾紙吸干后放入4％中性甲醛固定，其余放入液氮速凍后，-70℃保存。（2）Control組。動物松弛結扎雙后肢但不阻斷血流，其余操作同LIR組。（3）EPO+LIR組。于再灌注前30 min腹腔注射用NS配制的EPO 3 000 U/kg，其余操作同LIR組。LIR組和Control組亦在再灌注前30 min腹腔注射等量NS。

1.3 觀察指標（1）于再灌注4 h用激光多普勒灌注監測儀及Perisoft for Windows軟件實時記錄各組腎血流灌注量的變化。（2）全自動生化分析儀測定血漿肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）含量。（3）取-70℃凍存的腎組織依試劑盒說明書測定NO、NOS、ET-1含量。（4）稱取0.1 g腎組織于60℃烘干72 h，計算濕干重比值(W/D)。（5）經4％中性甲醛固定的腎組織，石蠟包埋、切片后，用免疫組織化學法及北航自動圖像分析系統測定VCAM-1和ICAM-1蛋白平均光密度（OD）值。HE染色后觀察組織的病理學變化。

1.4 統計學方法采用SPSS 15.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血漿Cr、BUN、W/D及腎血流量的比較見表1。LIR組較Control組腎血流量降低（P＜0.05），BUN、Cr和W/D升高（P＜0.05）；EPO+LIR組腎血流量低于Control組而高于LIR組，BUN、Cr和W/D高于Control組而低于LIR組（P＜0.05）。

Tab.1 Comparison of renal blood flow,BUN,Cr and W/D ratios of renal tissue between three groups表1 各組腎血流量、BUN、Cr和W/D比較（n=30，±s）

Tab.1 Comparison of renal blood flow,BUN,Cr and W/D ratios of renal tissue between three groups表1 各組腎血流量、BUN、Cr和W/D比較（n=30，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與Control組比較，b與LIR組比較，P＜0.05；表2、3同；Pu指單位時間內檢測到的血細胞數與血流速的乘積

組別Control組LIR組EPO+LIR組F腎血流量(pu) 274.55±26.55 162.67±13.37a215.99±19.75ab450.348＊＊BUN(mmol/L) 5.47±0.59 12.32±2.78a8.17±1.06ab174.703＊＊Cr(μmol/L) 32.89±5.28 70.12±8.47a56.54±6.21ab258.657＊＊W/D 2.43±0.11 3.57±0.18a2.99±0.14ab148.771＊＊

2.2 各組腎組織NO、NOS、ET-1比較LIR組NO、iNOS、tNOS和ET-1較Control組升高（P＜0.05）；EPO+LIR組NO、iNOS和tNOS、ET-1高于Control組而低于LIR組（P＜0.01），見表2。

Tab.2 Values of NO,iNOS,tNOS and ET-1 of renal tissue in three groups表2 各組NO、iNOS、tNOS和ET-1含量（n=30，±s）

Tab.2 Values of NO,iNOS,tNOS and ET-1 of renal tissue in three groups表2 各組NO、iNOS、tNOS和ET-1含量（n=30，±s）

組別Control組LIR組EPO+LIR組F NO （μmol/g）1.76±0.47 2.59±0.28a2.08±0.35ab58.148＊＊iNOS （U/mg）1.48±0.29 4.59±0.57a2.73±0.33ab628.473＊＊tNOS （U/mg）3.57±0.44 7.15±0.86a5.24±0.35ab357.941＊＊ET-1 （ng/L) 109.41±14.11 184.77±20.81a136.68±13.44ab203.247＊＊

2.3 腎組織ICAM-1和VCAM-1蛋白表達情況Control組可見腎小管上皮細胞內有ICAM-1和VCAM-1的弱陽性表達；LIR組與Control組相比，ICAM-1和VCAM-1表達增強；EPO+LIR組ICAM-1 和VCAM-1的表達比LIR組減弱，但仍比Control組強。各組ICAM-1和VCAM-1表達差異均有統計學意義（P＜0.01），見表3。

Tab.3 Values of average absorbance of ICAM-1 and VCAM-1 in three groups表3 腎臟ICAM-1和VCAM-1的平均OD值（n=10，±s）

Tab.3 Values of average absorbance of ICAM-1 and VCAM-1 in three groups表3 腎臟ICAM-1和VCAM-1的平均OD值（n=10，±s）

組別Control組LIR組EPO+LIR組F ICAM-1 0.135±0.016 0.406±0.025a0.267±0.021ab3 566.327＊＊VCAM-1 0.198±0.031 0.513±0.048a0.324±0.029ab968.896＊＊

2.4 腎組織形態觀察結果Control組腎小球無水腫，形態完整，腎小管管腔開放良好，無狹窄變形和炎細胞浸潤，腎組織結構基本正常。LIR組腎小球淤血水腫，腎間質有炎細胞浸潤，腎小管上皮細胞腫脹，管腔擴張。EPO+LIR組較LIR組腎小管上皮細胞腫脹和炎細胞浸潤所有減輕，見圖1。

3 討論

LIR常見于斷肢再植、肢體擠壓傷、四肢手術及游離肌瓣轉移等術后的缺血肢體。LIR還會累及遠隔器官，甚至造成多器官功能障礙綜合征（MODS），其中腎血流量減少出現最早，進而引起腎臟損傷[1]。EPO是一種由腎臟分泌的酸性糖蛋白激素，通過與靶細胞上的促紅細胞生成素受體結合發揮生物學效應[4]。有研究認為，EPO預處理能顯著改善血流動力學和心肌酶譜，保護心肌細胞超微結構[5]。Genc等[6]在大腦及神經元缺血再灌注損傷研究中發現，EPO能抑制神經元凋亡，減少梗死面積，保護腦組織及神經。Moeini等[7]研究顯示，在大鼠的腎臟缺血再灌注前2 h應用EPO可減輕大鼠腎臟損傷，但是其對遠隔器官肺臟并無保護作用。

本研究結果顯示，LIR組較Control組和EPO+ LIR組腎血流減少，血漿中Cr和BUN含量升高，光鏡下可見基底膜增厚、間隙增寬及炎細胞浸潤，表明大鼠LIR引發了遠隔器官—腎臟的結構損傷和功能障礙，提示此可能與腎血流量減少有關。腎血流量減少的可能機制有：（1）腎組織水腫。LIR組腎組織W/ D較另2組增大，表明腎組織水腫，而水腫液可壓迫腎血管，使腎血流量減少。（2）血管舒縮功能改變。LIR組縮血管物質ET-1較另2組增加顯著，雖然具有擴血管作用的NO含量及促進NO合成的NOS的活性也有所增加，但LIR組NO/ET-1較Control組明顯降低，因此腎血管收縮,腎血流量減少。（3）腎組織ICAM-1和VCAM-1表達增強。LIR組ICAM-1和VCAM-1均高于另2組，而ICAM-1和VCAM-1可介導細胞間的黏附及白細胞浸潤、貼壁，促進炎癥反應發生，并增大毛細血管后阻力，引起腎臟微循環障礙，降低血液流速，促進水腫發生。

EPO+LIR組與LIR組相比，腎血流量增加，腎臟的結構與功能均明顯改善，表明EPO增加了腎血流量，對腎臟起到保護作用。考慮可能機制有：（1）減輕腎水腫。EPO+LIR組W/D減小，表明腎水腫減輕，提示EPO降低了水腫液對血管的壓迫，使腎血流量增加。（2）促進血管活性物質平衡。EPO+LIR組NO、NOS、ET-1較LIR組均降低，但其NO/ET-1比LIR組大，表明EPO可促進腎血管舒張，有利于增加腎血流量。（3）減輕炎癥反應。EPO+LIR組腎組織ICAM-1和VCAM-1表達較LIR組減弱，表明EPO可減輕白細胞貼壁及炎癥反應，降低毛細血管后阻力，改善腎臟微循環，使腎血流增多，腎功能得以改善。

綜上所述，EPO預處理可在LIR后對腎臟起到保護作用，可為臨床預防和治療LIR繼發的腎功能衰竭提供新途徑。

Fig.1 The pathological changes of renal tissue under light microscope（HE×200）圖1 光鏡下腎組織的病理學改變（HE×200）

[1]汪濤,周業庭.急性肢體缺血再灌注損傷的研究進展[J].中華實驗外科雜志，2012，29(12):2628-2632.

[2]van Rijt WG,van Goor H,Ploeg RJ,et al.Erythropoietin-mediated protection in kidney transplantation:nonerythropoietic EPO derivatives improve function without increasing risk of cardiovascular events[J]. 2013,27(3):241-248.

[3]趙利軍,孔小燕,門秀麗,等.丹參對大鼠肢體缺血再灌注后多器官水腫的預防作用[J].天津醫藥,2012,40(8):806-808.

[4]皮欣靈,甘華.EPO的組織保護作用臨床應用研究進展[J].安徽醫藥,2013,17(1)137-139.

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（2013-11-04收稿2014-02-20修回）

（本文編輯陸榮展）

The Influence of Erythropoietin in Renal Blood Flow after Limb Ischemia Reperfusion in Rats

LIU Caishu,LI Weipeng,YAN Heyan,ZHANG Yaping,CAI Sen,MEN Xiuli,KONG Xiaoyan,LI Hongjie Department of Pathophysiology,Basic Medical College of Hebei United University,Tangshan 063000,China LI Hongjie,E-mail:hongrixuan@sina.com

ObjectiveTo investigate the influence and mechanism of erythropoietin(EPO)in renal blood flow after limb ischemia reperfusion(LIR).MethodsThirty male SD rats were randomly divided into control group,LIR group and EPO+LIR group with ten in each group.The values of renal blood flow,plasma creatinine(Cr),urea nitrogen(BUN)content in plasma,kidney tissue wet to dry ratio(W/D),nitric oxide(NO),nitric oxide synthase(NOS)and endothelin-1(ET-1)in renal tissue were detected in three groups.The immunohistochemistry assay was used to detect the expression of intercellular adhesion molecule(ICAM-1)and vascular cell adhesion molecule(VCAM-1)in renal tissue.The morphological changes of renal tissue were observed with light microscope.ResultsThe renal blood flow was significantly decreased,while the values of Cr,BUN,W/D,NO,ET-1,NOS,expressions of ICAM-1 and VCAM-1 was significantly increased in LIR group than those of control group(P＜0.05).Broaden interstitial and infiltration of inflammatory cells were observed in the renal tissue under light microscope.In the EPO+LIR group,the renal blood flow increased,the values of Cr,BUN,W/D,NO,ET-1 and NOS,expressions of ICAM-1 and VCAM-1 decreased significantly compared with those of LIR group(P＜0.05).The pathological changes were alleviated in EPO+LIR group.ConclusionEPO can improve renal function,increase renal blood flow in rats after LIR.The mechanism may be related to the decreased edema,changed renal vasomotor function and decreased inflammation.

reperfusion injury;extremities;renal plasma flow,effective;erythropoietin;rats,Sprague-Dawley;disease models,animal

R363.2；R977.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.010

河北聯合大學大學生創新性實驗計劃資助項目（X2013037）；河北聯合大學培育基金項目（LDPYS05，GP201301）

唐山，河北聯合大學基礎醫學院（郵編063000）

△通訊作者E-mail:hongrixuan@sina.com