β片層阻斷肽H102對PAP小鼠腦內ERK信號轉導通路的影響

王冰艷孫鳳仙林來祥徐淑梅△

β片層阻斷肽H102對PAP小鼠腦內ERK信號轉導通路的影響

王冰艷1孫鳳仙1林來祥2徐淑梅1△

目的研究β片層阻斷肽H102對PAP雙轉基因小鼠腦內ERK信號轉導通路的激活作用。方法將PAP雙轉基因小鼠隨機分為模型組和給藥組，每組10只，設同背景C57BL/6J小鼠為對照組。給藥組每日鼻腔給予H102溶液（5.8 mg/kg）5μL，對照組、模型組每日鼻腔給予等體積H102空白輔料溶液。30 d后行Morris水迷宮測試。之后采用免疫組化及免疫印跡技術觀察小鼠腦組織內RAS、P-MEK及P-ERK蛋白的表達變化。結果（1）Morris水迷宮測試。模型組小鼠學習記憶能力較對照組顯著降低，給藥組較模型組顯著提高（均P＜0.05）。（2）免疫組化及免疫印跡檢測結果。模型組腦內RAS、P-MEK及P-ERK表達較對照組顯著降低，給藥組蛋白表達較模型組顯著增高（均P＜0.01）。結論β片層阻斷肽H102可激活PAP雙轉基因小鼠腦內ERK信號轉導通路，增加神經細胞PAS、PMEK及P-ERK的含量，改善PAP小鼠學習記憶能力。

阿爾茨海默病；絲裂原激活蛋白激酶激酶類；小鼠，轉基因；投藥，鼻內；ERK信號轉導通路；β片層阻斷肽；RAS；P-MEK；P-ERK

β樣淀粉樣蛋白（amyloid beta-protein,Aβ）的神經毒性作用被公認是導致阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）發病的重要因素[1]。β片層阻斷肽可影響Aβ的β折疊和聚集，進而阻斷其神經毒性[2]。本課題組前期研究已證實β片層阻斷肽可明顯減少Aβ的表達和聚集，抑制神經細胞凋亡，改善模型小鼠的學習記憶能力[3]。ERK信號通路具有抗凋亡作用。有研究表明AD大鼠海馬中ERK蛋白表達顯著降低，空間學習、記憶能力減退[4-5]。本研究旨在觀察β片層阻斷肽H102鼻腔給藥對PAP雙轉基因小鼠腦內ERK信號轉導通路的激活作用，以探討H102是否通過ERK信號通路影響神經細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8月齡PAP雙轉基因小鼠20只，同月齡C57BL/6J小鼠10只，雌雄隨機提供，體質量（25.69±2.7）g，SPF級，購自中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究中心，飼養于天津醫科大學動物中心。

1.2 藥物及材料H102用固相合成法合成，高效液相色譜純化，經質譜儀（MS）分析鑒定純度均＞95％，由上海吉爾生化有限公司合成。DAB顯色試劑盒、即用型SABC免疫組化試劑盒及生物素二抗購自北京鼎國生物公司。RAS抗體購于Santa公司，P-ERK、P-MEK抗體購自CST公司，GAPDH抗體購于碧云天生物技術研究所，MT200-Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統購自成都泰盟科技有限公司。

1.3 動物分組與給藥方法采用隨機數字表法將PAP小鼠分為模型組、H102給藥組，每組10只。并設同月齡C57BL/6J小鼠10只為對照組。H102給藥組每日經鼻腔給予濃度為5.8 mg/kg的H102溶液5μL，對照組和模型組經鼻腔給予等體積的H102空白輔料溶液（0.5％殼聚糖、0.1％BSA），每日給藥1次。

1.4Morris水迷宮測試給藥30 d后，行Morris水迷宮實驗。（1）定位航行實驗。將平臺置于水迷宮的第三象限中央，每天相同時段小鼠游泳訓練2次，每次90 s，將小鼠從相鄰象限同一入水點放入水中，記錄小鼠尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期。若小鼠在90 s內未找到平臺，則將其引至平臺停留20 s，逃避潛伏期記為90 s，歷時5 d。（2）空間探索實驗。于水迷宮的第6天撤去平臺，在相同時段每只小鼠游泳1次，計時90 s。記錄小鼠在平臺所在第三象限停留時間（residence time in the third quadrant,RTQ）、跨越隱匿平臺的次數及入水朝向角等指標測試小鼠的記憶能力。

1.5 免疫組化染色Morris水迷宮實驗結束后，10％水合氯醛腹腔注射，開腹后用PBS經左心室灌注至肝肺透明，小鼠斷頭取腦，一半腦組織放入4％多聚甲醛溶液內固定，一半腦組織分離海馬與皮質放入液氮中備用。甲醛固定后的腦組織制成海馬、皮質相關區域冠狀切片，切片脫蠟至水后以3％ H2O2室溫孵育10 min及枸櫞酸緩沖液微波沸騰抗原修復。5％正常山羊血清封閉。之后滴加按一定比例稀釋的一抗（RAS 1∶50，P-MEK 1∶200，P-ERK 1∶200）工作液，4℃過夜后滴加適量生物素標記二抗工作液及辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色劑顯色3～15 min。陰性對照組用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗進行免疫組化染色，其余步驟同上。在正立顯微成像系統下觀察并拍攝切片相同層次海馬及皮質，用IPP 6.0軟件對圖片灰度進行分析。

1.6Western blot分析于液氮中取出分離的小鼠海馬和皮質組織，以100 mL RIPA的裂解液加1％PMSF蛋白酶抑制劑及去磷酸化抑制劑于冰上進行勻漿，所得組織勻漿在4℃恒溫13 000×g離心20 min，取上清，BCA法測定蛋白后調定各組蛋白為等濃度，加適量上樣緩沖液，煮沸變性3 min。10％～12％分離膠電泳分離蛋白后濕轉到PVDF膜上，PVDF膜用5％脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗（RAS 1∶500，P-MEK 1∶1 000，P-ERK 1∶1 000）），4℃搖床過夜，加入稀釋的二抗（1∶5 000），室溫下孵育2 h，然后化學發光法曝光，用ImageJ圖像處理軟件分析所得條帶的光密度（OD）值。

1.7 統計學方法采用SPSS 16.0軟件處理數據，計量數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法，多重比較采用SNK-q法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 行為學測試結果

2.1.1 定位航行實驗模型組、給藥組逃避潛伏期長于對照組，第2天起給藥組小鼠較模型組縮短（均P＜0.05）,見表1。

Tab.1 Comparison of average escape latency in navigation test between three groups of mice表1 3組小鼠定位航行實驗平均逃避潛伏期比較（n=10,s,±s）

Tab.1 Comparison of average escape latency in navigation test between three groups of mice表1 3組小鼠定位航行實驗平均逃避潛伏期比較（n=10,s,±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05；表2～4同

組別對照組模型組給藥組F 1 d 67.62±10.67 88.53±1.54a88.91±1.15a53.005＊＊2 d 60.90±8.39 85.66±4.87a75.97±6.47ab8.181＊＊組別對照組模型組給藥組F 3 d 40.15±7.97 86.90±3.68a64.75±13.2ab97.509＊＊4 d 25.06±12.07 75.59±11.49a46.69±8.95ab80.768＊＊5 d 30.56±10.39 62.21±18.25a40.96±7.18ab23.775＊＊

2.1.2 空間探索實驗模型組RTQ少于對照組，給藥組較模型組延長，仍少于對照組（均P＜0.05）。模型組跨越隱匿平臺次數少于對照組（P＜0.05），給藥組較模型組跨越次數增加（P＜0.05）。模型組入水朝向角大于對照組，給藥組較模型組減小，仍大于對照組（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of RTQ,frequency span hidden platform and the corner into the water in space exploration experiment between three groups of mice表2 3組小鼠空間探索實驗RTQ、跨越隱匿平臺次數及入水朝向角比較（n=10,±s）

Tab.2 Comparison of RTQ,frequency span hidden platform and the corner into the water in space exploration experiment between three groups of mice表2 3組小鼠空間探索實驗RTQ、跨越隱匿平臺次數及入水朝向角比較（n=10,±s）

組別對照組模型組給藥組F RTQ（s）14.12±1.43 8.50±2.48a11.57±1.26ab36.429＊＊跨越平臺次數（次/90 s）2.46±0.83 0.53±0.74a1.93±0.80b23.793＊＊入水朝向角（°）30.27±2.85 46.54±6.76a33.66±2.38ab55.738＊＊

2.2ERK信號轉導通路相關蛋白免疫組織化學結果（1）RAS。RAS蛋白存在于細胞胞漿內，對照組腦內神經細胞胞漿著色明顯，RAS蛋白平均光密度值較高；模型組胞漿著色淺，蛋白表達低于對照組，給藥組胞漿著色變深，蛋白表達較模型組增高，但仍低于對照組（均P＜0.05），見圖1，表3。（2）P-MEK與P-ERK。小鼠腦內P-MEK蛋白位于胞漿內，染色時胞漿著棕色，模型組切片胞漿著色較淡，蛋白表達低于對照組，給藥組胞漿著色明顯，蛋白表達較模型組、對照組均增高（均P＜0.05），見圖2，表3。小鼠腦內P-ERK蛋白部分位于胞漿，部分移位于核內，模型組蛋白表達低于對照組，給藥組蛋白表達較模型組增高，但仍低于對照組（均P＜0.05），見圖3，表3。

Tab.3 The expression of purpose protein detected by immunohistochemistry表3 目的蛋白免疫組化表達（n=10,×105,±s）

Tab.3 The expression of purpose protein detected by immunohistochemistry表3 目的蛋白免疫組化表達（n=10,×105,±s）

組別對照組模型組給藥組F RAS 7.38±0.44 3.88±0.75a5.38±0.53ab105.595＊＊P-MEK 7.31±0.90 5.28±0.74a8.16±0.86ab37.659＊＊P-ERK 1.74±0.16 1.06±0.17a1.23±0.15ab59.882＊＊

2.3ERK信號轉導通路相關蛋白Western blot結果（1）RAS。模型組蛋白表達低于對照組，給藥組高于模型組及對照組（均P＜0.05）。（2）P-MEK和PERK。模型組腦內P-MEK蛋白表達水平低于對照組，給藥組高于模型組及對照組（均P＜0.05）；模型組腦內P-ERK蛋白表達低于對照組（P＜0.05），給藥組蛋白表達高于模型組，見圖4、5，表4。

Fig.4 RAS and P-ERK protein expression in mouse detected brain by Western blot assay圖4 小鼠腦內RAS、P-ERK蛋白Western結果

Fig.5 P-MEK protein expression in mouse brain by Western blot assay圖5 小鼠腦內P-MEK蛋白Western結果

Tab.4 The expression of purpose protein detected by Western blot assay表4 目的蛋白Western表達結果（n=10,±s）

Tab.4 The expression of purpose protein detected by Western blot assay表4 目的蛋白Western表達結果（n=10,±s）

組別對照組模型組給藥組F RAS 0.596±0.055 0.516±0.040a0.739±0.052ab46.684＊＊P-MEK 0.409±0.021 0.357±0.043a0.502±0.029ab46.866＊＊P-ERK 0.693±0.014 0.652±0.035a0.709±0.011b14.929＊＊

3 討論

AD是一個包括輕度認知損害（mild cognitive impairment,MCI）在內的連續的疾病過程，其重要病理學特征是Aβ錯誤折疊聚集而形成的老年斑，Aβ二級結構中β折疊的形成是聚集所必需的[6]。β片層阻斷肽可與Aβ結合，減少Aβ的聚集和老年斑的形成，從而抑制其下游病理過程，但具體機制尚不清楚。本課題前期研究已經證實β片層阻斷肽可減少凋亡相關蛋白Bad的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達[7]。Bad蛋白家族與ERK信號轉導通路可發生多位點的相互作用，Bad可活化R-RAS及其活性區域，亦可被RAF激酶活化。同時ERK可作為Bad的上游作用激酶，P-ERK可磷酸化Bad ser112位點，磷酸化后的Bad與14-3-3蛋白結合并滯留于胞漿，從而使Bad的促凋亡作用受到抑制[8]。

ERK屬于MAPK家族，被激活后轉位于細胞核內，磷酸化并激活轉錄因子，調控基因的表達，引起細胞的增殖和分化[9]。RAS-MEK-ERK信號轉導通路可以被生長因子受體、PLC等激活。有研究表明少量Aβ可激活ERK，同時NADPH氧化酶抑制劑可阻斷上述作用，這種現象可出現在AD早期[10]。在AD患者及PAP雙轉基因小鼠腦內神經生長因子減少，ERK表達減少，給予相應生長因子、何首烏等中草藥或抗糖尿病藥物后ERK通路相關蛋白表達增強，AD轉基因小鼠癥狀改善[11]。另外RAS可能介導Aβ引起的線粒體損害和突觸傳遞障礙[12]。低強度激光療法，丙戊酸等治療可激活RAS/ERK通路，改善AD癥狀[13-14]。因此ERK信號轉導通路在AD發病和治療中的多個點位均具有重要作用。

本實驗通過Morris水迷宮測試發現PAP雙轉基因小鼠學習記憶能力較對照組明顯減弱，H102給藥組較模型組學習記憶能力提高，提示給予β片層阻斷肽H102后PAP雙轉基因小鼠神經細胞凋亡減少，學習記憶能力得到改善。免疫組化檢測顯示模型組腦內RAS、P-MEK及P-ERK蛋白表達均低于對照組，給藥組表達均較模型組增高。而免疫印跡檢測顯示模型組腦內RAS、P-MEK、P-ERK蛋白表達均低于對照組，給藥組表達較模型組及對照組均明顯增高。即PAP雙轉基因小鼠腦內ERK信號轉導通路受到抑制，而β片層阻斷肽H102可激活ERK信號轉導通路，結合本課題前期研究提示β片層阻斷肽H102可能通過激活ERK通路產生抗凋亡作用。同時由于ERK通路還參與胰島素作用，記憶相關蛋白的激活，因此β片層阻斷肽H102通過ERK通路介導的作用可能不止于抗凋亡。本研究結果中個別蛋白給藥組表達高于對照組，可能由于ERK信號轉導通路與AD其他通路有交叉作用，β片層阻斷肽H102可通過多個位點激活ERK通路相關蛋白，導致給藥組相關蛋白表達較對照組增加。另外RAS、P-ERK蛋白免疫組化與免疫印跡實驗各組對比不對應，可能由于免疫組化為半定量測量，其數值與切片位置、細胞多少均有較大關系，導致出現與免疫印跡測試不同的結果。

本實驗采取鼻腔給藥途徑，藥物從鼻腔上皮轉運到中樞神經系統（CNS）的精確通路和機制還沒有被完全闡明。有研究證明經鼻腔給予大分子物質分別可沿著鼻腔上皮嗅神經和三叉神經通路傳遞到達嗅球和腦干，再從這些初始腦部入口進一步散布到其他腦區域[15]，本研究認為β片層阻斷肽H102經鼻路徑入腦后除可以抑制Aβ聚集，影響相關蛋白表達，通過多種機制發揮治療作用。

Fig.1 The expression of RAS protein in mouse brain detected by immunohistochemistry(Immunohistochemistry，×400)圖1 小鼠腦內RAS蛋白免疫組化表達（免疫組化，×400）

Fig.2 The expression of P-MEK protein in mouse brain detected by immunohistochemistry(immunohistochemistry,×400)圖2 小鼠腦內P-MEK免疫組化表達（免疫組化,×400）

Fig.3 The expression of P-ERK protein in mouse brain detected by immunohistochemistry(Immunohistochemistry，×400)圖3 小鼠腦內P-ERK蛋白免疫組化表達（免疫組化，×400）

[1]孫欣,楊宇,吳江.β淀粉樣蛋白在阿爾茨海默病中所致的細胞內毒性作用[J].中風與神經疾病雜志,2011,28(3):277-279.

[2]Zhao J,Xu SM.Inhibitory activities of β-sheet breakers on aggregation and toxicity of β-amyloid protein[J].Chin J New Drugs Clin Rem,2008,27(9):675-679.[趙娟,徐淑梅.β片層阻斷肽對淀粉樣β蛋白聚集和毒性的抑制作用[J].中國新藥與臨床雜志,2008, 27(9):675-679.]

[3]Li M,Lin LX,Xu SM.Effects of H102 on cholinergic system and free radicals of APP transgenic mouse[J].Chin J New Drugs Clin Rem,2009,28(2):106-110.[李梅,林來祥,徐淑梅.H102對APP轉基因小鼠膽堿能系統及自由基的影響[J].中國新藥與臨床雜志,2009,28(2):106-110.]

[4]Kaminska B,Gozdz A,Zawadzka M,et al.MAPK signal transduction underlying brain inflammation and gliosis as therapeutic target[J]. Anat Rec,2009,292(12):1902-1913.

[5]Cui X,Wang B,Zong Z,et al.The effects of chronic aluminum exposure on learning and memory of rats by observing the changes of Ras/Raf/ERK signal transduction pathway[J].FoodChem Toxicol, 2012,50(2):315-319.

[6]Kuperstein I,Broersen K,Benilova I,et al.Neurotoxicity of Alzheimer’s disease Aβ peptides is induced by small changes in the Aβ42 to Aβ40 ratio[J].EMBO J,2010,29(19):3408-3420.

[7]Sun FX,Wang M,Xu YL，et al.The combined effects of β-sheet breaker and Hucmsc on APP transgenic mice[J].Chin J Appl Physiol,2013,29(3):239-244.[孫鳳仙,王曼,徐艷玲,等.β片層阻斷肽聯合人臍帶間充質干細胞對APP轉基因鼠的治療作用[J].中國應用生理學雜志,2013,29(3):239-244.]

[8]Mendoza MC,Er EE,Blenis J.TheRas-ERK and PI3K-mTOR pathways:cross-talk and compensation[J].Trends BiochemSci,2011, 36(6):320-328.

[9]Burkhard K,Smith S,Deshmukh R,et al.Development of extracellular signal-regulated kinase inhibitors[J].Curr Top Med Chem, 2009,9(8):678.

[10]Serrano F,Chang A,Hernandez C,et al.NADPH oxidase mediates β-amyloid peptide-induced activation of ERK in hippocampal organotypic cultures[J].Mol Brain,2009,2(1):31.

[11]BomfimTR,Forny-Germano L,Sathler LB,et al.An anti-diabetes agent protects the mouse brain from defective insulin signaling caused by Alzheimer’s disease–associated Aβ oligomers[J].J Clin Invest,2012,122(4):1339.

[12]Szatmari EM,Oliveira AF,Sumner EJ,et al.Centaurin-α1-Ras-Elk-1 Signaling at Mitochondria Mediates β-Amyloid-Induced Synaptic Dysfunction[J].J Neurosci,2013,33(12):5367-5374.

[13]Meng C,He Z,Xing D.Low-Level Laser Therapy Rescues Dendrite Atrophy via Upregulating BDNF Expression:Implications for Alzheimer’s disease[J].J Neurosci,2013,33(33):13505-13517.

[14]Zhang XZ,Li XJ,Zhang HY.Valproic acid as a promising agent to combat Alzheimer’s disease[J].Brain Res Bull,2010,81(1):3-6.

[15]Thorne RG,Hanson LR,Ross TM,et al.Delivery of interferon-β to the monkey nervous system following intranasal administration[J]. Neuroscience,2008,152(3):785-797.

（2014-03-21收稿2014-05-23修回）

（本文編輯李國琪）

The Effects of β-Sheet Breaker Peptide H102 on ERK Signal Transduction Pathway in Brain of PAP Double Transgenic Mice

WANG Bingyan1,SUN Fengxian1,LIN Laixiang2,XU Shumei1
1 Department of Physiology,2 Institute of Endocrinology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China XU Shumei，E-mail:xushm@tijmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the activation of β-sheet breaker peptide H102 on ERK signal transduction pathway in brain of PAP double transgenic mice.MethodsPAP double transgenic mice were randomly divided into model group and H102 treatment group(n=10 for each group).A group of C57BL/6J mice with the same genetic background was served as controls.H102(5.8 mg/kg)5μL was infused by intranasal administration to mice in H102 treatment group,and equal volume of blank solution of H102(chitosan,BSA)was given to mice in control group and model group.The ability of spatial reference memory was tested by Morris water maze after 30 days of treatment.Then immunohistochemistry tests and Western blot technique were used to detect the content of RAS,P-MEK and P-ERK proteins in mouse brain.Results(1) The ability of learning and memory was significantly lower in model group than that of control group.The ability of learning and memory was significantly improved in treatment group than that in model group(P＜0.05).(2)The contents of RAS,PMEK and P-ERK in mouse brain were significantly lower in model group than those of control group,and these protein expressions were significantly increased in treatment group than those in model group(P＜0.01).Conclusionβ-sheet breaker peptide H102 can activate ERK signal transduction pathway in brain of PAP double transgenic mice,increase PAS,PMEK and P-ERK levels in nerve cells,and improve the ability of learning and memory in PAP mice.

Alzheimer disease;mitogen-activated protein kinase kinases;mice,transgenic;administration,intranasal;ERK signal transduction pathway;β-sheet breaker;RAS;P-MEK;P-ERK

R742

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.007

國家科技重大專項基金資助項目（2009ZX09103-029）；天津市科技支撐重點項目（09ZCKFSH00100）

1天津醫科大學生理教研室（郵編300070）；2內分泌研究所

△通訊作者E-mail:xushm@tijmu.edu.cn