限進材料的制備及其應用*
——介紹一個儀器分析綜合實驗

王超展李溟 衛(wèi)引茂

(西北大學合成與天然功能分子化學教育部重點實驗室化學與材料科學學院 陜西西安710069)

限進材料的制備及其應用*
——介紹一個儀器分析綜合實驗

王超展**李溟 衛(wèi)引茂

(西北大學合成與天然功能分子化學教育部重點實驗室化學與材料科學學院 陜西西安710069)

介紹一個儀器分析綜合實驗,利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合技術制備反相限進材料;以該材料為基礎,建立牛奶中4種塑化劑的固相萃取-高效液相色譜分析方法。

儀器分析實驗 限進材料 高效液相色譜 牛奶 塑化劑

隨著生命科學、食品科學和環(huán)境科學等領域的發(fā)展,相關樣品分析已成為分析化學非常重要的任務。目前,色譜法是復雜樣品分析中最常用的方法,在生物、食品和環(huán)境分析中得到了非常廣泛的應用。然而,在分析上述樣品之前,必須對樣品進行前處理。首先,這些樣品一般都含蛋白質(zhì)、核酸、腐殖酸等物質(zhì),它們會吸附在固定相表面,造成色譜柱污染甚至堵塞,嚴重影響分離效率和色譜柱使用壽命;其次,對于痕量和超痕量分析而言,待分析物含量可能遠低于儀器檢測水平,必須對其進行富集;另外,這些樣品中的基質(zhì)非常復雜,很容易對分析造成干擾,因此需要對樣品進行凈化。簡單、快速、高效、綠色的樣品前處理方法對于提高樣品分析的準確度、精密度和分析效率具有重要意義[1]。下面結合我們的科研工作介紹一個儀器分析綜合實驗,該實驗涉及吸附分離材料制備、生物樣品前處理、高效液相色譜分析方法建立等方面的內(nèi)容。整個實驗過程需要130小時。

1 實驗目的

(1)了解生物樣品的特殊性并掌握生物樣品分析的全過程。

(2)認識生物樣品前處理的重要性,熟悉限進材料的原理。

(3)了解限進材料的制備方法和應用。

2 實驗原理

固相萃取(SPE)技術是一種由柱色譜和液固萃取技術相結合的樣品前處理技術。其基本原理與液相色譜相似,根據(jù)待分析物在溶液和吸附劑兩相間的作用強度或分配能力不同,與吸附劑作用力強的或者分配系數(shù)大的物質(zhì)會被優(yōu)先吸附,作用力很弱的或者分配系數(shù)很小的物質(zhì)作為不保留組分流出,從而實現(xiàn)對目標物的分離、純化和富集。與液液萃取相比,固相萃取具有以下優(yōu)點:(1)溶劑耗費小;(2)操作簡單、快速;(3)易于收集目標組分;(4)可處理微量試樣;(5)可在線或離線操作,可與其他儀器聯(lián)用。然而,在處理生物樣品時,蛋白質(zhì)、腐植酸和核酸等會與待分析物同時吸附在固相萃取柱上,從而造成干擾。

限進材料是近年來生物分析中廣泛采用的一類樣品前處理材料,它能有效吸附小分子化合物,而排除(不吸附)蛋白質(zhì),因此能夠有效去除或降低蛋白質(zhì)對小分子分析的干擾。限進材料的出現(xiàn)極大地提高了生物樣品分析的速度、準確度和重現(xiàn)性,并有利于分析過程自動化[1]。限進材料一般具有雙層結構:內(nèi)層為小分子結合層;外層為親水性的大分子屏蔽層,多為具有抗蛋白吸附性能的二醇基親水性聚合物[2]或蛋白質(zhì)[3]。限進材料對蛋白質(zhì)的排除作用就是通過親水層的化學擴散屏障或化學擴散屏障與孔徑限制的物理屏障相結合來實現(xiàn)的。

原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)是近年發(fā)展起來的一種高分子合成技術,它在吸附分離材料制備方面的應用也逐漸引起了廣泛關注。本實驗采用ATRP技術制備反相限進材料,并用于牛奶中4種塑化劑的分析。

3 儀器與試劑

3.1 儀器

傅立葉變換紅外光譜儀(布魯克,德國),紫外-可見分光光度計(島津,日本),高效液相色譜儀(島津,日本),固相萃取裝置(Sigma-Aldrich,美國),SinoChrome ODS-BP色譜柱(4.6mm×200mm,5μm,依利特,大連)。

3.2 試劑

HF254型薄層硅膠(青島海洋化工廠),甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(上海晶純試劑有限公司),(對-氯甲基)-苯基三氯硅烷(百靈威科技有限公司),十八烷基三氯硅烷(百靈威科技有限公司);牛血清白蛋白和溶菌酶購自西安沃爾森生物技術有限公司,葛根素(安康市天源植物提取有限公司)、對羥基苯甲醛(阿拉丁試劑)、氯雷他定、硝苯地平和地西泮購自中國藥品生物制品檢定所,吡啶、溴化亞銅、2,2-聯(lián)二吡啶、甲苯、鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丙酯(DPrP)和鄰苯二甲酸二異丁酯(DiBP)購自國藥集團化學試劑有限公司,脫脂牛奶購自本地超市(使用前分別用濾紙和濾膜過濾)。

4 實驗內(nèi)容

4.1 反相限進材料的制備

4.1.1 硅膠活化

將薄層硅膠分別過200目和320目篩,取中間粒徑硅膠。取2.0g篩分后的硅膠,加入到50mL圓底燒瓶,再加入30mL 6mol/L鹽酸,超聲10min。攪拌下110℃回流4h。用砂芯漏斗抽濾,并用蒸餾水洗滌至中性。120℃下真空干燥8h。

4.1.2 硅膠硅烷化

稱取1.0g活化硅膠,置于50mL三頸燒瓶中,加入20mL無水甲苯,超聲15min。將0.1mL對-氯甲基-苯基三氯硅烷和0.4mL十八烷基三氯硅烷溶解在5mL無水甲苯中,用滴液漏斗緩慢滴加。120℃回流攪拌24h。抽濾,依次用甲苯、甲醇、丙酮洗滌改性硅膠。60℃真空干燥8h。

4.1.3 在硅膠表面接枝聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(pGMA)

稱取0.2g硅烷化硅膠,置于50mL三口燒瓶中,加入10mL異丙醇,再加入1mL甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA),超聲3min。通氮氣30min,冷凍—抽真空—解凍—通氮氣循環(huán)3次,迅速加入40mg溴化亞銅和128mg 2,2-聯(lián)二吡啶。再次冷凍—抽真空—解凍—通氮氣。在氮氣保護下,40℃下反應24h,通入空氣終止反應。抽濾,依次用異丙醇、甲醇、水、丙酮洗滌產(chǎn)物。將改性硅膠轉(zhuǎn)移至50mL圓底燒瓶中,加入20mL 0.2mol/L EDTA溶液,60℃下絡合4h,以去除吸附的銅離子。再依次用水、甲醇洗滌。60℃真空干燥8h。

4.1.4 環(huán)氧基水解

將表面接枝pGMA的改性硅膠置于50mL圓底燒瓶中,加入20mL 30%四氫呋喃水溶液,再加入2mL 0.25mol/L硫酸,60℃水解8h。依次用水、甲醇洗滌,40℃真空干燥8h,即得到反相限進材料。

4.1.5 限進材料的紅外光譜表征

采用KBr壓片法分別測定活化硅膠、硅烷化硅膠和反相限進材料的紅外光譜圖,分析并對比譜圖,推斷材料制備是否成功。

4.2 分析方法的建立與驗證

4.2.1 HPLC條件

色譜條件如下:色譜柱:SinoChrome ODS-BP色譜柱(4.6mm×200mm,5μm);流動相:65%乙腈水溶液;流速:1mL/min;檢測波長:240nm;進樣體積:20μL。

4.2.2 固相萃取條件

稱取200mg反相限進材料,裝填于10mL空柱管中,制成固相萃取小柱。將待處理樣品上樣至用50mmol/L PBS(pH7.4)平衡過的固相萃取柱,用2mL 30%甲醇淋洗,再用3mL甲醇洗脫,用氮氣吹干洗脫組分,將殘留物溶于0.20mL 65%乙腈。圖1是牛奶加標樣在固相萃取前后的色譜圖。可以看出,經(jīng)過固相萃取后,牛奶樣品中的蛋白和其他基質(zhì)對塑化劑分析的干擾大大降低,同時塑化劑得到了富集,大大提高了檢測靈敏度。

圖1 反相限進材料對牛奶加標樣的處理效果牛奶加標樣中各種塑化劑均為15μg/L。a.固相萃取前;b.固相萃取后1.鄰苯二甲酸二甲酯;2.鄰苯二甲酸二乙酯;3.鄰苯二甲酸二丙酯;4.鄰苯二甲酸二丁酯

4.2.3 制作標準曲線

將一定體積的塑化劑混合溶液(含DMP、DEP、DPrP和DiBP質(zhì)量濃度均為100mg/L)加入到70mL牛奶中,分別配制含各種塑化劑質(zhì)量濃度為0.3、1.0、3.0、10.0、30.0、100和300μg/L的標準工作溶液;每個標準工作溶液經(jīng)固相萃取處理后進行HPLC分析,每次測定重復3次,以質(zhì)量濃度對峰面積平均值作圖,分別得到DMP、DEP、DPrP和DiBP的線性方程和線性范圍(表1)。

表1 分析方法的線性關系及線性范圍

4.2.4 回收率和重現(xiàn)性

取20mL牛奶3份,分別加入20μL(樣品1)、60μL(樣品2)、120μL(樣品3)塑化劑混合液(DMP、DEP、DPrP和DiBP的質(zhì)量濃度均為100mg/L),經(jīng)固相萃取處理后進行HPLC分析,每次測定重復3～6次,計算加標質(zhì)量回收率和相對標準偏差(RSD),結果見表2。

表2 分析方法的回收率和相對標準偏差(n=6)

4.2.5 最低檢測限和最低定量限

最低檢測限(LOD)定義為3.3(Sy/b),最低定量限(LOQ)定義為10(Sy/b)。Sy是將含各種塑化劑濃度均為10μg/L的牛奶樣品平行進行6次SPE-HPLC分析后,所得峰面積的標準偏差,b是標準曲線的斜率。表3是所得各物質(zhì)的檢測限和定量限。

表3 檢測限和定量限

5 數(shù)據(jù)處理

(1)以質(zhì)量濃度對峰面積平均值作圖,分別得到DMP、DEP、DPrP和DiBP的標準工作曲線,包括線性范圍、線性相關系數(shù)、標準偏差。

(2)計算4種塑化劑的回收率和相對標準偏差。

(3)計算LOD和LOQ。

6 實驗注意事項

(1)ATRP反應中要充分除氧。

(2)硅烷化反應中要采用無水甲苯。

(3)用液氮冷凍過程中要注意安全。

(4)實驗中應采用滿環(huán)進樣以提高進樣精密度。

(5)實驗結束后要對色譜柱和色譜儀進行清洗。

7 總結

隨著生命科學發(fā)展以及人們對食品安全和環(huán)境保護的關注,生物分析、食品分析和環(huán)境分析已成為分析化學中的主要任務。“限進材料的制備及其應用”作為化學相關專業(yè)的儀器分析綜合實驗,能夠使學生通過吸附分離材料制備、樣品前處理、分析條件優(yōu)化、樣品分析測定以及數(shù)據(jù)分析處理等環(huán)節(jié)的學習和實踐,掌握復雜生物樣品分析的全過程。本實驗對學生進一步消化、吸收和運用課堂所學理論知識具有重要作用,有利于提高學生解決復雜問題的能力。而且,實驗中的樣品是與人們生活密切相關的,待分析物也是近年來各方頗為關注的污染物和非法添加物,可增強學生參與實驗的積極性和主動性,調(diào)動學生的學習興趣。

[1] Gil G C,Brennan J,Throckmorton D J,et al.JChromatog B,2011,879:1112

[2] Xu W,Su S,Jiang P,et al.JChromatog A,2010,1217(46):7198

[3] Wa C,Mallik R,Hage D S.Anal Chem,2008,80(22):8751

陜西省科技廳社發(fā)攻關項目(No.2013K13-02-10,2013-2014);西安市科技計劃項目(No.CXY1344(1));西北大學本科教學質(zhì)量與教學改革工程項目(No.JX12020,2013-2014)

**通訊聯(lián)系人,E-mail:czwang@nwu.edu.cn