外周血T淋巴細胞亞群與不同分子分型乳腺癌患者無病生存的相關(guān)性研究

冀 為 周 巖 牛瑞芳

外周血T淋巴細胞亞群與不同分子分型乳腺癌患者無病生存的相關(guān)性研究

冀 為 周 巖 牛瑞芳

目的：觀察不同分子分型浸潤性乳腺癌患者外周血T淋巴細胞亞群的表達情況，分析乳腺癌患者免疫狀態(tài)與不同分子分型乳腺癌的相關(guān)性。方法：選取2008年1月至2009年8月初診于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺中心的患者372例。均對入組患者采血，采用流式細胞術(shù)分析外周血的T淋巴細胞的亞群CD4+T細胞、CD8+T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）及自然殺傷（NK）細胞水平。分析CD4+/CD8+比值的大小、調(diào)節(jié)性T細胞、自然殺傷細胞的免疫相關(guān)指標與乳腺癌不同分子分型Luminal A、Luminal B、HER-2過表達型以及三陰性乳腺癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果：372例乳腺癌患者中，Luminal A型為133例（35.8%）、Luminal B型為124例（33.3%）、HER-2過表達型為48例（12.9%）、三陰性為67例（18.0%）。在三陰性乳腺癌中外周血CD4+/CD8+比值越高，患者的無病生存時間越長（P＜0.05），Treg細胞含量越低，患者的無病生存時間也越長（P＜0.05），但CD4+/ CD8+比值與Treg細胞含量并非三陰性乳腺癌無病生存的獨立預(yù)后因素。而其他三種類型的乳腺癌中，CD4+/CD8+比值、Treg細胞含量與患者無病生存率無關(guān)（P＞0.05）。NK細胞含量與以上4種分子分型乳腺癌患者的無病生存率并無明顯的相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論：外周血CD4+/CD8+比值、Treg細胞含量可有效預(yù)測三陰性乳腺癌的無病生存率，但并非其獨立的預(yù)后因素。

乳腺癌 外周血 免疫細胞 Treg細胞 NK細胞

2012年公布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，女性惡性腫瘤中乳腺癌的發(fā)病率約占10%，每年近140萬女性罹患乳腺癌［1］。隨著對乳腺癌生物學(xué)行為研究的不斷深入，現(xiàn)階段對早期乳腺癌的認識已經(jīng)從局限性疾病提高到即使在疾病發(fā)展的早期，乳腺癌同樣是一個易危及全身的惡性腫瘤［2］。在影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展的眾多因素中，患者的免疫功能與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］，其中CD4+/CD8+、Treg細胞和NK細胞是近年來最受關(guān)注的4項免疫學(xué)指標。造成乳腺癌轉(zhuǎn)移的原因之一是患者機體免疫功能低下，而機體的免疫功能也會隨著乳腺癌的進展而持續(xù)下降。本研究旨在分析乳腺癌患者免疫狀態(tài)與不同分子分型乳腺癌的臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，以了解外周血T淋巴細胞亞群水平在不同分子分型乳腺癌中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 研究對象均為2008年1月至2009年8月初診于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺外科的早期乳腺癌患者。篩選條件：1）臨床分期Ⅰ～Ⅲ期，經(jīng)根治或保乳手術(shù)治療；2）術(shù)前未經(jīng)放、化療；3）有完整的臨床資料，包括年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、組織學(xué)分級、病理類型、家族史、治療方式等；4）有較為完整的隨訪資料，包括復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的時間、部位及死亡時間，且隨訪期至2014年7月，隨訪時間滿5年；5）術(shù)前對外周血T淋巴細胞亞群水平進行了流式細胞術(shù)分析。經(jīng)篩選滿足以上5個條件的病例共372例。

1.1.2 抗體 CD4-PE，CD8-FITC，CD3-PerCP-Cy5 -5-A，CD127-APC，CD25-PE，CD45-PerCP-Cy5-5-A，CD3-FITC，CD16+56-PE抗體，均購自美國BD公司。

1.1.3 流式細胞儀 FACSCantoⅡ型，購自美國BD公司。

1.1.4 正置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng) BX61型，購自日本Olympus株式會社。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 采用正置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)對免疫組織化學(xué)法染色切片進行觀察，10×40高倍視野下隨機選擇5個視野。ER和PR的表達以細胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，HER-2的表達以細胞膜呈現(xiàn)黃色或棕黃色為陽性染色，Ki-67的表達以細胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。陽性判斷標準：ER、PR陽性指陽性細胞占15%以上者。根據(jù)美國臨床腫瘤協(xié)會和美國病理學(xué)醫(yī)師學(xué)院發(fā)布的HER-2檢測臨床實踐指南（2006年）［4］：免疫組織化學(xué)法檢測HER-2受體表達，染色0或（+）判定為陰性，（+++）者判定為陽性，（++）者需要進一步應(yīng)用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）進行驗證，F(xiàn)ISH結(jié)果陽性判定為陽性，相反則判定為陰性。

1.2.2 乳腺癌分子分型 本研究依據(jù)St.Gallen乳腺癌分子等的“固有基因亞群”分類（2011年）將乳腺癌分為以下4種類型：1）Luminal A型：ER和/或PR陽性，HER-2陰性，Ki-67≤14%；2）Luminal B型：ER和/或PR陽性，HER-2陽性，任何Ki-67比例；或者ER和/或PR陽性，HER-2陰性，Ki-67＞14%；3）HER-2過表達型：ER和PR陰性，HER-2過表達或擴增；4）三陰性：ER和PR陰性，HER-2陰性。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測 取EDTA抗凝血2 mL，PBS稀釋至4 mL，F(xiàn)icoll分離淋巴細胞，PBS洗滌2次，吸取100 μL淋巴細胞懸液，加10 μL上述單克隆抗體于室溫暗處孵育15 min，再加0.5 mL PBS重懸，采用流式細胞儀檢測。其中CD3+CD4+代表CD4+T細胞，CD3+CD8+代表CD8+T細胞，CD4+CD25+CD127-代表Treg細胞，CD45+CD3-（CD16+/CD56+）代表NK細胞。CD4+/CD8+比值以1.4為界分為高和低2組，Treg細胞及NK細胞分別以8%和20%為界各分為高和低2組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理。采用χ2檢驗行組間率的比較及臨床病理特征的分析；利用Kaplan-Meier法對2組資料的生存函數(shù)進行評估；利用Log rank法中的組間比較法對2組間生存時間的差異進行檢驗；DFS單因素或多因素分析應(yīng)用Cox風(fēng)險回歸模型，多因素分析應(yīng)用Wald檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分子分型患者的外周血T淋巴細胞亞群比較

根據(jù)免疫組織化學(xué)法檢測患者ER、PR、HER-2以及Ki-67的表達情況。在372例乳腺癌患者中Luminal A型133例（35.8%）、Luminal B型124例（33.3%）、HER-2過表達型48例（12.9%）、三陰性67例（18.0%）。在乳腺癌不同分子分型中對CD4+/CD8+比值的高低、Treg細胞及NK細胞含量的高低等3項免疫相關(guān)指標進行比較，發(fā)現(xiàn)不同分子分型患者中其淋巴細胞的表達情況處于不同表達水平。CD4+/CD8+比值在不同組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），Treg細胞含量在不同組間的差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而NK細胞含量在不同組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

2.2 外周血CD4+/CD8+比值、Treg細胞及NK細胞含量對不同分子分型乳腺癌患者無病生存率的影響

利用Kaplan-Meier法比較不同分子分型乳腺癌中外周血CD4+/CD8+高比值組與低比值組、Treg細胞及NK細胞高含量組與低含量組的無病生存率。結(jié)果顯示，僅在三陰性乳腺癌中CD4+/CD8+高比值組與低比值組的無病生存率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且CD4+/CD8+高比值組的無病生存率較低比值組更高（圖1）；Treg細胞高含量組比低含量組更易發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移（P＜0.05，圖2）。而在Luminal A、Luminal B及HER-2過表達型乳腺癌中，CD4+/CD8+比值的高低對這3種類型乳腺癌患者的無病生存率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1），Treg細胞含量的高低對這3種類型乳腺癌患者的無病生存率的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2），NK細胞含量的高低對以上4種類型的乳腺癌患者的無病生存率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。

2.3 三陰性乳腺癌患者無病生存率的單因素及多因素分析

利用Kaplan-Meier法進行單因素分析，發(fā)現(xiàn)影響三陰性乳腺癌患者無病生存率的因素包括年齡、淋巴結(jié)情況、腫物大小、CD4+/CD8+比值以及Treg細胞含量（P＜0.05）。將上述相關(guān)因素納入到Cox多因素分析中，發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+比值及Treg細胞含量并非三陰性乳腺癌患者無病生存率的獨立預(yù)后因素（表2）。

表1 不同分子分型患者的外周血T淋巴細胞亞群比較Table 1 Comparison of peripheral blood T-lymphocyte subpopulations in patients with different molecular subtypes

圖1 外周血CD4+/CD8+比值對不同分子分型乳腺癌患者無病生存率的影響Figure 1 Effect of CD4+/CD8+ratio in peripheral blood on DFS of patients with different molecular subtypes of breast cancer

圖2 外周血Treg細胞含量對不同分子分型乳腺癌患者無病生存率的影響Figure 2 Effect of Treg cell count in peripheral blood on the DFS of patients with different molecular subtypes of breast cancer

圖3 外周血NK細胞含量對不同分子分型乳腺癌患者無病生存率的影響Figure 3 Effect of the amount of NK cells in peripheral blood on DFS of patients with different molecular subtypes of breast cancer

表2 三陰性乳腺癌患者的無病生存率相關(guān)Cox多因素分析Table 2 DFS-related Cox multivariate analysis of patients with triple-negative breast cancer

3 討論

免疫缺陷易導(dǎo)致自發(fā)和病毒誘發(fā)的惡性腫瘤的發(fā)展，而惡性腫瘤往往能產(chǎn)生免疫抑制的微環(huán)境，阻止抗腫瘤免疫的產(chǎn)生，成為影響免疫治療療效的重大障礙［5］。淋巴細胞（包括T細胞、Treg細胞和NK細胞）與乳腺癌的初級預(yù)防和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，患者的預(yù)后可能與免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)有關(guān)［6］。本研究以外周血T淋巴細胞亞群為研究對象，對患者的免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)進行評估，重點探討了CD4+/CD8+比值、Treg細胞和NK細胞含量與不同分子分型乳腺癌患者無病生存率的相關(guān)性。

Bilik等［7］研究表明，CD4+/CD8+比值可以顯著體現(xiàn)機體/腫瘤免疫監(jiān)視。陳明水等［8］研究證實乳腺癌患者的CD4+/CD8+比值較正常人低，Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者的CD4+/CD8+比值較Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者低，而本研究證實CD4+/CD8+比值在不同分子分型乳腺癌中的表達情況不同，且在三陰性乳腺癌中CD4+/CD8+高比值組患者的預(yù)后顯著優(yōu)于低比值組。

正常生理條件下，Treg細胞在維持免疫平衡、防止自身免疫反應(yīng)的重要機制中起到免疫抑制調(diào)節(jié)作用；而在腫瘤病理條件下，Treg細胞功能上調(diào)和誘導(dǎo)增高能有效、系統(tǒng)地抑制免疫系統(tǒng)的反應(yīng)性，造成腫瘤免疫耐受加劇，降低免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視作用，從而使腫瘤產(chǎn)生免疫逃逸［9］。國內(nèi)外研究表明，肺癌、卵巢癌、胃腸道腫瘤等多種腫瘤患者都存在外周血和局部腫瘤Treg細胞含量增高的現(xiàn)象［10-12］。未經(jīng)治療的乳腺癌患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg細胞的表達顯著高于健康人（P＜0.01），證實患者外周血中Treg細胞含量增加可能引起乳腺癌免疫逃逸，并可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用［13］。本研究的結(jié)果表明Treg細胞含量在不同分子分型乳腺癌中的表達情況不同，且在三陰性乳腺癌中Treg細胞含量低組的患者的預(yù)后顯著優(yōu)于Treg細胞含量高組。Hong等［14］也得到了近似的結(jié)果，乳腺癌免疫功能與ER陰性或三陰性乳腺癌密切相關(guān)。

總之，盡管外周血CD4+/CD8+比值、Treg細胞含量并非三陰性乳腺癌患者獨立的預(yù)后因素，但研究表明上述二者可有效預(yù)測三陰性乳腺癌患者的無病生存率，并可在有效評估患者免疫功能狀態(tài)的基礎(chǔ)上，進一步預(yù)測乳腺癌患者的預(yù)后。

1 Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2012,62(1)：10-29.

2 Redig AJ,McAllister SS.Breast cancer as a systemic disease：a view of metastasis[J].J Intern Med,2013,274(2)：113-126.

3 Jia Y,Xu L,Lin Q,et al.Levels of lymphocyte subsets in peripheral blood prior treatment are associated with aggressive breast cancer phenotypes or subtypes[J].Med Oncol,2014,31(6)：981.

4 Wolff AC,Hammond ME,Schwartz JN,et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer[J].Arch Pathol Lab Med,2007,131(1)：18-43.

5 Amarante MK,Watanabe MA.The possible involvement of virus in breast cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(3)：329-337.

6 Standish LJ,Sweet ES,Novack J,et al.Breast cancer and the immune system[J].J Soc Integr Oncol,2008,6(4)：158-168.

7 Bilik R,Mor C,Hazaz B,et al.Characterization of T-lymphocyte subpopulations infiltrating primary breast cancer[J].Cancer Immunol Immunother,1989,28(2)：143-147.

8 Chen MS,Chen Q,Ye YB,et al.Alteration of cell immunologic function in 33 cases of patients with breast cancer and their clinical significance[J].Fujian Medicine,2003,25(3)：18-20.［陳明水,陳 強,葉韻斌,等.乳腺癌病人細胞免疫功能的變化及其意義[J].福建醫(yī)藥雜志,2003,25(3)：18-20.］

9 Xiao T,Kagami S,Saeki H,et al.Both IL-4 and IL-13 inhibit the TNF-alpha and IFN-gamma enhanced MDC production in a human keratinocyte cell line,HaCaT cells[J].J Dermatol Sci,2003,31 (2)：111-117.

10 Hermann C,Assmus B,Urbich C,et al.Insulin-mediated stimulation of protein kinase Akt：A potent survival signaling cascade for endothelial cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(2)：402-409.

11 Molenaar ET,Voskuyl AE,Familian A,et al.Complement activation in patients with rheumatoid arthritis mediated in part by C-reactive protein[J].Arthritis Rheum,2001,44(5)：997-1002.

12 Fan J,Ren H,Zhang FC,et al.Research in CD4+CD25+CD127-regulatory T cells in different TNM stages malignant tumor patients[J]. Chin Med J,2011,46(9)：70-71.［樊 靜,任 紅,張鳳春,等.不同TNM分期惡性腫瘤患者外周血CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細胞的研究[J].中國醫(yī)刊,2011,46(9)：70-71.］

13 Lin ZM,Liu H,Gao QL,et al.Peripheral blood of breast cancer regulatory T cells and its significance[J].Modern Preventive Medicine,2011,38(12)：2258-2260.［林志明,劉 慧,高全立,等.乳腺癌患者外周血中調(diào)節(jié)性T細胞的表達及意義[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2011,38 (12)：2258-2260.］

14 Hong CC,Yao S,McCann SE,et al.Pretreatment levels of circulating Th1 and Th2 cytokines,and their ratios,are associated with ER-negative and triple negative breast cancers[J].Breast Cancer Res Treat,2013,139(2)：477-488.

（2014-07-22收稿）

（2014-09-24修回）

冀為 專業(yè)方向為乳腺癌發(fā)病分子機制，乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究。

E-mail：jiwei217@126.com

·讀者·作者·編者·

重視HPV16/18分型檢測完善宮頸癌篩查策略

2014年5月18日，由中國醫(yī)師協(xié)會婦產(chǎn)科醫(yī)師分會主辦的“HPV和宮頸癌篩查策略研討會”在北京召開。國內(nèi)20多位宮頸癌篩查領(lǐng)域知名婦產(chǎn)科和病理專家共同出席，圍繞宮頸癌篩查策略，交流國際最新研究成果，分析現(xiàn)有篩查方法，共同探討HPV檢測在中國作為一線初篩的可行性、對HPV16/18基因分型的重要性、以及不同篩查結(jié)果后續(xù)的追蹤管理方式。

《美國婦產(chǎn)科雜志》2013年對10種宮頸癌篩查策略進行了比較研究，臨床上綜合比較各種篩查策略發(fā)現(xiàn)，對HPV16/18分型的HPV檢測、結(jié)合細胞學(xué)分流的篩查策略，可最佳平衡篩查敏感性和特異性，及時檢出需轉(zhuǎn)診陰道鏡的高風(fēng)險人群，同時減少過度陰道鏡轉(zhuǎn)診帶來的危害。

適宜的篩查方案應(yīng)具有四大特點：較好的特異性和敏感性是有效篩查的基礎(chǔ)和前提；技術(shù)方法需簡便易行，便于實施；公眾可接受，便于推行；滿足衛(wèi)生經(jīng)濟學(xué)適宜要求，便于開展。

一項持續(xù)10年的統(tǒng)計不同高危型別HPV感染后≥CIN2病變累積發(fā)病率的研究證實，基線篩查時HPV16和或18陽性，10年后高度病變的累積發(fā)病率明顯高于其它型別感染或HPV陰性者，因此需要在HPV篩查時包含對16/18的分型，這也是美國FDA批準cobas HPV可用于宮頸癌一線初篩的理論基石。同時，基于目前最新的國外數(shù)據(jù)，相比HC2技術(shù)，cobas HPV檢測不僅具備同等的篩查效力，還可通過對HPV16/18基因分型對風(fēng)險分層，且具備內(nèi)質(zhì)控、自動化、高通量等優(yōu)勢。

——引自“中國醫(yī)學(xué)論壇報”

Effect of T-lymphocyte subpopulations in peripheral blood on disease-free survival of patients with different molecular subtypes of breast cancer

Wei JI,Yan ZHOU,Ruifang NIU

Ruifang NIU;E-mail:niuruifang@tjmuch.com
Public Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center of Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China.

Objective:To determine the distribution of T-lymphocyte subpopulations in peripheral blood and its relationship with disease-free survival(DFS)of patients with different molecular subtypes of invasive breast cancer(IBC).Methods:Data and plasma samples of 372 female patients with IBC treated at Tianjin Medical University Cancer Hospital and Institute between January 2008 and August 2009 were obtained.CD4+/CD8+ratio and the amount of regulatory T cells(Treg cells)and natural killer cells(NK cells)were measured through flow cytometry.Results:A total of 133(35.8%),124(33.3%),48(12.9%),and 67 cases(18.0%)presented luminal type A,luminal type B,HER-2 over-expression,and triple-negative type breast cancer(TNBC),respectively.In TNBC,a longer DFS was observed when the peripheral CD4+/CD8+ratio was high or when the level of Treg cells was low(CD4+/CD8+P＜0.05 and Treg P＜0.05).However,CD4+/CD8+and Treg are not independent prognostic factors for the DFS of TNBC cases.In other molecular subtypes of breast cancer,CD4+/CD8+ratio and the amount of Treg cells are not correlated with DFS(P＞0.05).The level of NK cells is unrelated to the DFS of breast cancer with the four molecular subtypes(P＞0.05).Conclusion:CD4+/CD8+ratio and the amount of Treg cells in peripheral blood may predict DFS of TNBC but are not considered as independent prognostic factors.

breast cancer,peripheral blood,immune cells,Treg cells,NK cells

10.3969/j.issn.1000-8179.20141221